【技术实现步骤摘要】
201610237704
【技术保护点】
一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO‑meAg5的制备方法,其特征在于,主要包含以下过程:MO基因组的提取;MO基因组表达文库的构建;MO抗原基因的免疫学筛选;MO‑多表位融合抗原基因的构建方法;MO多表位融合抗原基因在大肠杆菌中的表达;其具体过程如下:MO基因组的提取:将纯化后的菌株转接于培养基中,于36~38℃、浓度为4~6%的CO2培养箱中培养5~9天,当生长滴度达到109CCU/ml及以上时,10000~16000r/min离心10~20min,收集菌体,弃上清,然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit提取试剂盒提取得到绵羊肺炎支原体的总DNA;所述培养基为脑心浸液肉汤培养基(BD,USA);MO基因组表达文库的构建:用Sau3A I酶对MO总DNA进行酶切,使酶切的基因组片段集中于0.5~3kb,然后按照酶切体系Sau3A I酶于36~38℃,酶切0.5~1.5ug基因组DNA 2~2.5h进行酶切。将酶切的片段通过T4DNA连接酶连接于经BamH I酶切并去磷酸化处理的PET28表达载体中,然后将连接产物转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞中,涂布于含有卡那霉素 ...
【技术特征摘要】
1.一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5的制备方法,其特征在于,主要包含以下过程:MO基因组的提取;MO基因组表达文库的构建;MO抗原基因的免疫学筛选;MO-多表位融合抗原基因的构建方法;MO多表位融合抗原基因在大肠杆菌中的表达;其具体过程如下:MO基因组的提取:将纯化后的菌株转接于培养基中,于36~38℃、浓度为4~6%的CO2培养箱中培养5~9天,当生长滴度达到109CCU/ml及以上时,10000~16000r/min离心10~20min,收集菌体,弃上清,然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit提取试剂盒提取得到绵羊肺炎支原体的总DNA;所述培养基为脑心浸液肉汤培养基(BD,USA);MO基因组表达文库的构建:用Sau3A I酶对MO总DNA进行酶切,使酶切的基因组片段集中于0.5~3kb,然后按照酶切体系Sau3A I酶于36~38℃,酶切0.5~1.5ug基因组DNA 2~2.5h进行酶切。将酶切的片段通过T4DNA连接酶连接于经BamH I酶切并去磷酸化处理的PET28表达载体中,然后将连接产物转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞中,涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上,于36~38℃培养12~14h;按照分子克隆技术提取质粒,再将其转入BL21大肠杆菌感受态细胞中,同样涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上,于36~38℃培养12~14h;得到含有绵羊肺炎支原体基因片段的大肠杆菌,既绵羊肺炎支原体基因组表达文库;MO抗原基因的免疫学筛选:将所构建的绵羊肺炎支原体基因组表达文库等份稀释,涂于含有卡那霉素抗性的LB平板上36~38℃培养7~8h;将克隆菌复制于硝酸纤维素膜上置于一个新的含卡那霉素LB平板上培养2~3h后,再将此含菌的NC膜置于含有1~1.2mM的IPTG的LB琼脂板,36~38℃培养4~6h.然后将有细菌菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15~25min,于空气中干燥;将NC膜放入裂解液中于室温缓慢摇动14~16h;然后将NC膜放入TBST缓冲液中漂洗3~5次,每次20~30min;将NC膜再放入膜封闭液(TIANGEN)中室温缓慢晃动1~1.5h.再用TBST缓冲液漂洗2~4次,每次10~20分钟;再将NC膜放入用封闭缓冲液按1:2500~1:3500稀释被处理过的阳性血清中,室温孵育1~1.5h,分别用含0.05~0.15%BSA的TBST缓冲液、含有0.05~0.15%BSA和0.05~0.15%Tween-20的TBST缓冲液、含0.05~0.15%BSA的TBST缓冲液各洗涤3~5min;最后将NC膜放入用封闭缓冲液按1:4500~1:5500稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG溶液中,室温孵育1~1.5h后,用TBST缓冲液洗涤3~5次,每次30~40min;用TMB显色液覆盖于NC膜上,挑取NC膜上颜色较深的阳性斑点反复进行筛选验证;挑选出阳性克隆菌在10ug/ml~50ug/ml的卡那霉素的LB液体中培养,当其OD600nm...
【专利技术属性】
技术研发人员:乔军,陈诚,孟庆玲,胡政香,马玉,田路路,卢海亭,曹旭东,陈创夫,
申请(专利权)人:石河子大学,
类型:发明
国别省市:新疆;65
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