【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物技术检测领域，具体涉及一种停乳链球菌的lamp引物组、试剂盒以及检测方法。
技术介绍
1、牛源停乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，严重危害奶牛健康。停乳链球菌对人的危害也不容忽视，随着患慢性病老年人的逐渐增多，停乳链球菌引起的菌血症报告率在2％-18％之间，对人类的危害正在不断扩大。
2、环介导等温扩增技术作为一种新型核酸检测技术，它是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用bst dna聚合酶的链置换活性在同一反应体系中恒温高效扩增，大量合成目的dna的同时，产生白色焦磷酸镁沉淀。由于扩增反应依赖于靶dna的6个独立的区域，因此特异性非常高。一般借助恒温水浴锅即可满足实验温度需求，适合基层的快速检测。但现有技术中关于停乳链球菌的lamp检测技术的灵敏度并不高，而且其仅仅表示的是对提取纯化后停乳链球菌的检测结果，不是直接指示采样品中停乳链球菌的感染情况，同样无从考究对采样品的检测限和灵敏度。
技术实现思路
1、针对以上技术问题，本专利技术提供一种停乳链球菌的lamp引物组、试剂盒以及检测方法。以停乳链球菌gapc基因为靶基因设计环介导等温扩增引物，利用lamp技术实现停乳链球菌的快速检测，为停乳链球菌的检测提供了有效且快速的筛查方法。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用了如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种基于lamp技术的停乳链球菌检测引物组，引物组核苷酸序列如下所示：
4、f3：act
5、b3：gttgatttcgtcaacagaaacgt；
6、fip：tagctttagcagcaccagttgagtt-tggtggtgaccttcgtcg；
7、bip：aatggtaaacttgatggtgctgcac-tcaagagttacaaccaactcagt；
8、lf：gtttgcagcaccagcacgag；
9、lb：aacgtgttcctgttccaactggat。
10、其中，正向外引物f3，其核苷酸序列如seq id no.1所示；反向外引物b3，其核苷酸序列如seq id no.2所示；正向内引物fip，其核苷酸序列如seq id no.3所示；反向内引物bip，其核苷酸序列如seq id no.4所示，正向环引物lf，其核苷酸序列如seq id no.5所示，反向环引物lb，其核苷酸序列如seq id no.6所示。该引物组以停乳链球菌gapc基因为靶基因，按照引物设计原则进行设计，经过筛选分析后最终确定。该引物组能特异性扩增停乳链球菌的dna，结合显色反应或凝胶电泳图像，能够快速鉴定检测停乳链球菌。
11、第二方面，本专利技术提供上述引物组在制备试剂盒中的应用，试剂盒可用于鉴定停乳链球菌或检测待测样本中是否含有停乳链球菌。
12、第三方面，一种检测停乳链球菌的试剂盒，含有上述的引物组以及lamp反应所需的反应体系。
13、第四方面，本专利技术提供一种检测待测样本中是否含有停乳链球菌的方法，含有如上述的引物组，包括以下步骤：
14、s1：提取待检样品总dna；
15、s2：以s1中提取的总dna为模板，用权利要求1所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒进行lamp扩增；
16、s3：鉴定结果：如果采用s2中所述引物组或试剂盒可以实现以所述总dna为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有停乳链球菌；
17、所述方法用于非疾病诊断与治疗。
18、将提取待检样品的细菌总dna，加入含有本专利技术所提供的特异性引物组的lamp反应体系进行等温扩增反应，后根据结果判断生鲜乳中是否含有停乳链球菌。在实际检测中，待检样品中的低浓度细菌以及存在的干扰物质会阻碍dna提取，或是提取到到dna浓度过低，使用的检测方法不能正确反应待检样品中是否含有停乳链球菌以及其浓度。与现有技术相比，本专利技术所建立的方法，具有简便、快速、特异性高，灵敏性强，可视化灵敏度可达到102copies/μl，琼脂糖凝胶电泳灵敏度可达到101copies/μl。
19、进一步地，s3中鉴定结果的方法为加入用于判断待鉴定样品dna是否成功扩增的显色材料至lamp反应体系中，通过反应体系显色状态作为鉴定结果；或取lamp扩增产物，点样于琼脂糖凝胶，观察凝胶成像系统中成像结果作为鉴定结果。
20、在扩增完成后的反应体系中加入显色材料，混匀，肉眼观察显色状态，对照阳性对照品和阴性对照品的显色状态即可判断生鲜乳中是否含有停乳链球菌；吸取一定量的lamp扩增产物，加入到琼脂糖凝胶中进行电泳检测，肉眼观察电泳结果，如出现阶梯式条带判为阳性，即检测生鲜乳中含有停乳链球菌；如不出现阶梯式条带则判为阴性，即检测生鲜乳中不含有停乳链球菌。
21、进一步地，lamp扩增在25μl或50μl lamp扩增体系中进行；lamp扩增体系包括，内引物、外引物、环引物、dntp、dna模板、bst dna聚合酶、buffer、无酶水；体系中内引物与外引物浓度比为4-10:1，体系中内引物终浓度为8.0-20.0μm/l。
22、建立停乳链球菌gapc基因的单重lamp反应体系，与常见的无乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等无交叉反应，特异性验证高，可视化灵敏性为9.53×102copies/μl，琼脂糖凝胶电泳检测的灵敏性为9.53×101copies/μl。
23、示例性地，本专利技术提供一种可视化的25μl的lamp扩增体系包括：
24、warmstart colorimetric lamp 2×master mix 12.5μl
25、10×primers 2.5μl(8.0-20.0μm fip/bip、2μm f3/b3、4μm lf/lb)
26、dna模板1.0-5.0μl
27、无酶水加至25μl。
28、使用lamp变色预混液，反应结束后肉眼即可观察颜色反应，在阴性对照呈红色或橙红色、阳性对照呈黄色的前提下，待检样品呈黄色判为阳性，即检测生鲜乳中含有停乳链球菌；待检样品呈红色或橙红色判为阴性，即检测生鲜乳中不含有停乳链球菌。
29、更进一步地，体系中内引物与外引物浓度比为8:1，体系中内引物终浓度为16.0μm/l。
30、优化后内外引物比例，可减少引物比例对整个可视化lamp检测方法的影响。
31、进一步地，进行lamp扩增的温度为61-64℃。
32、进一步地，反应时间为30-60min。
33、更进一步地，进行lamp扩增的温度为62-63℃。
34、更进一步地，反应时间为30min。
35、进一步地，待测样本为生鲜乳；所述提取待检样品总dna的方法为edta-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于LAMP技术的停乳链球菌检测引物组，其特征在于，所述引物组核苷酸序列如下所示：
2.根据权利要求1所述的引物组在制备试剂盒中的应用：所述试剂盒的用途鉴定停乳链球菌或检测待测样本中是否含有停乳链球菌。
3.一种检测停乳链球菌的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的引物组以及LAMP反应所需的反应体系。
4.一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，含有如权利要求1所述的引物组，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，所述S3中鉴定结果的方法为加入用于判断待鉴定样品DNA是否成功扩增的显色材料至LAMP反应体系中，通过反应体系显色状态作为鉴定结果；或取LAMP扩增产物，点样于琼脂糖凝胶，观察凝胶成像系统中成像结果作为鉴定结果。
6.根据权利要求4所述的一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，所述LAMP扩增在25μL或50μL LAMP扩增体系中进行；所述LAMP扩增体系包括，内引物、外引物、环引物、dNTP、DNA模板、Bst DNA聚合酶、无酶
7.根据权利要求6所述的一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，所述体系中内引物与外引物浓度比为8:1，体系中内引物终浓度为16.0μM/L。
8.根据权利要求4-7任意一项所述的检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于：所述进行LAMP扩增的温度为61-64℃；和/或
9.根据权利要求8所述的一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，所述进行LAMP扩增的温度为62-63℃；和/或
10.根据权利要求4所述的一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，所述待测样本为生鲜乳；所述提取待检样品总DNA的方法为EDTA-Tris法。
...【技术特征摘要】
1.一种基于lamp技术的停乳链球菌检测引物组，其特征在于，所述引物组核苷酸序列如下所示：
2.根据权利要求1所述的引物组在制备试剂盒中的应用：所述试剂盒的用途鉴定停乳链球菌或检测待测样本中是否含有停乳链球菌。
3.一种检测停乳链球菌的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的引物组以及lamp反应所需的反应体系。
4.一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，含有如权利要求1所述的引物组，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，所述s3中鉴定结果的方法为加入用于判断待鉴定样品dna是否成功扩增的显色材料至lamp反应体系中，通过反应体系显色状态作为鉴定结果；或取lamp扩增产物，点样于琼脂糖凝胶，观察凝胶成像系统中成像结果作为鉴定结果。
6.根据权利要求4所述的一种检测待测样本中停乳链球菌的方法，其特征在于，所述lamp扩...
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