一种肺炎支原体检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光免疫层析技术的肺炎支原体IgM的试剂盒和检测方法。本发明专利技术的方法是使用荧光素作为标记材料，标记小鼠抗人的IgMμ链单克隆抗体。血清中的肺炎支原体特异性IgM抗体与荧光素标记抗体结合形成反应复合物，被肺炎支原体抗原捕获，肺炎支原体IgM捕获量与荧光抗体的信号强度呈正相关，通过免疫荧光检测仪读数，可检测出血清中的肺炎支原体IgM。本发明专利技术的方法具有时间短、特异性好、良好的精确性和稳定性等特点，与欧盟肺炎支原体IgM检测试剂盒检测结果符合率较高。为临床上快速准确检测肺炎支原体IgM提供一种新方法，具有良好的市场前景。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术涉及一种肺炎支原体的检测方法，具体涉及一种基于荧光免疫层析技术的肺炎支原体的检测方法，还涉及采用该方法的检测试剂盒。

技术介绍

肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)是一种能在无生命培养基上自行繁殖的原核生物，不易染色，没有细胞壁。有研究显示MP引起的呼吸道感染约占社区获得性肺炎的20-40％(Principi，N.，etal：Clininfectiousdiseases，2001；32：1281-1289.)。据统计，大约每年约10万成人因为MP的感染住院治疗。肺炎支原体的临床症状不明显，有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，由于MP无细胞壁，故其引起感染的治疗与其它细菌和病毒感染在治疗方法上有所不同。因此快速、准确诊断MP感染对于治疗很重要。
目前，检测MP的主要方法是MP分离培养、PCR检测、冷凝集试验、血清特异性抗体检测等几个方面，各有优缺点。病原体分离培养被认为是疾病诊断的金标准，但MP培养要求条件很高，需要的时间较长(约6周)，故对于临床患者的治疗无实用性，所以很少实验室通过培养来诊断患者是否为MP感染。目前PCR方法检测MP的P1蛋白、16SrRNA及其它蛋白基因已经有大量报道(Waveren，G.，etal：JClinmicrobiology，1999；37：14-17.)，但PCR方法操作复杂，需要有相关的仪器，实验员必须经过专门的培训，所以在一些基层单位很难推广。冷凝集试验为非特异性反应，除了在MP感染时可呈阳性外，也可见于肝病、溶血性贫血、传染性单核细胞增多症等，并且如果第一次血液标本采集的较晚，或者患者的抵抗力比较弱，检测结果也可能为阴性(Sanchez-Vargas，F.M.，etal：Clinmicrobiologyandinfection，2008；14，：105-117.)。
应用最广泛的血清学检测是ELISA，需要很少量的血清就可以进行此试验。但酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒操作繁琐，费时费力的弊端阻碍了它在即时检验中的应用。能够应用于即时检验的血清学检测方法是免疫层析方法，该方法操作简单、快速、方便、结果易于判断、无须特殊的检测设备，已在临床检验、食品安全监督与环境监控各领域得到了广泛的应用。市场上大部分免疫层析产品采用胶体金作为检测标记物，以定性和半定量为主(Kosack，C.S.，etal：Jvirologicalmethods，2014；204：6-10.)。但应用光学仪器进行半定量检测时，胶体金试纸条通常只能检测硝酸纤维素膜表面10-20μm的光学信号，损失了近80-90％的信号。
MP血清抗体的检测有IgM和IgG两种，IgM在感染7～10天后就可以被检测到(Talkington，D.F.，etal：Clinicalanddiagnosticlaboratoryimmunology，2004；11：862-867.)。由于MP感染的潜伏期为2～3周，单独检测IgG非常容易假阴性而导致漏诊误诊，而IgM一般在感染后一周出现，3～4周达到高峰，当患者出现症状就诊时，IgM抗体已达到较高水平，故IgM抗体的检测有助于MP的早期诊断。
目前，国内外采用荧光免疫层析方法检测肺炎支原体IgM抗体的研究还未见报道。选择荧光素作为标记材料来替代胶体金，建立荧光免疫层析方法将具备胶体金免疫层析简单、快速的优势，又能够具有更高的敏感性，有利于MP感染的快速、准确诊断。

技术实现思路

本专利技术还公开了一种基于荧光免疫层析技术的肺炎支原体检测试剂盒，该肺炎支原体检测试剂盒包括在聚氯乙烯(PVC)底板上依次贴附的样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；其中荧光垫为包覆有荧光素标记鼠抗人的IgM抗体和荧光素标记羊抗兔IgG抗体的玻璃纤维垫；硝酸纤维素膜检测线包被有肺炎支原体抗原，质控线包被有兔IgG抗体。标记的荧光素为近红外荧光素，优选荧光素Alexa647。鼠抗人的IgM抗体为IgMμ链单克隆抗体。硝酸纤维素膜采用SatouriusCN140。肺炎支原体抗原为重组P1抗原和天然抗原，其中肺炎支原体重组P1抗原购自深圳菲鹏生物股份有限公司，天然抗原购自Microbix公司。P1蛋白是肺炎支原体的主要免疫原性蛋白和粘附蛋白之一，目前已成为肺炎支原体临床检测的主要靶标(Li，W.，etal：Scientificreports，2015；5：15539.)。本专利技术选择的肺炎支原体重组P1抗原是P1蛋白的C末端片段，具有较高的免疫原性(Chourasia，B.K.，etal：BMCmicrobiology，2014；14：108.)。天然抗原是肺炎支原体标准菌株FH，采用乙醚灭活，能够尽可能捕获大多数肺炎支原体特异性IgM。综合重组P1抗原检测肺炎支原体的特异性，和天然抗原检测肺炎支原体的敏感性，可以提高本专利技术检测试剂的性能。
本专利技术还公开了荧光素Alexa647在制备荧光免疫层析检测试剂中的用途，特别是在制备肺炎支原体检测试剂中的用途。本专利技术选择荧光素Alexa647作为新型荧光标记材料，它是一种明亮稳定的远红外光染料，人眼不可见但是能够被大多数的成像系统接收。在本专利技术的检测肺炎支原体的方法中，Alexa647的NHS酯能够与抗体的首个氨基结合而不损害抗体的生物活性，相较于其他类似荧光，具有更高的荧光强度，更好的耐光性，能够大大降低背景荧光的干扰。目前Alexa647还未应用于肺炎支原体免疫层析检测试剂，相较于胶体金，Alexa647作为标记材料能够提高试剂的敏感性；相较于量子点和时间分辨等微球标记材料，Alexa647能够保证试剂的精确性，CV值更低。
本专利技术还公开了一种检测肺炎支原体的方法，该方法是基于荧光免疫层析技术，采用本专利技术公开的检测试剂盒，检测血清样本中的肺炎支原体IgM抗体。
本专利技术的检测血清样本中肺炎支原体的方法包括以下步骤：使用荧光素作为标记材料，标记小鼠抗人的IgMμ链单克隆抗体。当血清与缓冲液混合，并滴加到免疫层析膜上，血清中的肺炎支原体特异性IgM抗体与荧光素标记抗体结合形成反应复合物，反应复合物随着层析作用沿着硝酸纤维素膜前移，被硝酸纤维素膜检测线上包被的肺炎支原体重组P1抗原和天然抗原捕获，血清中的肺炎支原体IgM捕获量与荧光抗体的信号强度呈正相关，通过免疫荧光检测仪读数，可检测出血清中的肺炎支原体IgM。
其中荧光素为近红外荧光素，优选荧光素Alexa647。鼠抗人的IgM抗体为IgMμ链单克隆抗体，肺炎支原体抗原为重组P1抗原和天然抗原，重组P1抗原是P1蛋白的C末端片段，天然抗原是肺炎支原体标准菌株FH。硝酸纤维素膜采用SatouriusCN140，样品稀释液表面活性剂添加2％Tween-20，较其它表面活性剂，层析效果更快。
对本专利技术的试剂盒，通过绘制ROC曲线确定Cutoff值，对试剂的性能进行考察。结果显示，(1)基于荧光免疫层析技术的肺炎支原体IgM快速检测试剂的最佳反应时间为10min，能够快速获得检测结果；(2)具有良好的特异性，与其它几种常见的呼吸道病原体无交叉反应；(3)具有良好的精确性，批内和批间变异系数均小于15％；(4)具有良好的稳定性，能够于常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于荧光免疫层析技术的肺炎支原体检测试剂盒，包括在聚氯乙烯底板上依次贴附的样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中荧光垫为包覆有荧光素标记鼠抗人的IgM抗体和荧光素标记羊抗兔IgG抗体的玻璃纤维垫；硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线包被有肺炎支原体抗原，质控线包被有兔IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光免疫层析技术的肺炎支原体检测试剂盒，包括在聚氯乙烯底板
上依次贴附的样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中荧光垫为包覆
有荧光素标记鼠抗人的IgM抗体和荧光素标记羊抗兔IgG抗体的玻璃纤维
垫；硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线包被有肺炎支原体抗原，质
控线包被有兔IgG抗体。
2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其中荧光素为近红外荧光素。
3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其中荧光素为荧光素4.根据权利要求1所述检测试剂盒，其中鼠抗人的IgM抗体为IgMμ链单克隆
抗体。
5.根据权利要求1所述检测试剂盒，其中硝酸纤维素膜采用SatouriusCN140。
6.根据权利要求1所述检测试剂盒，其中肺炎支原体抗原为重组P1抗原和天

【专利技术属性】
技术研发人员：欧黎明，孙丽华，
申请(专利权)人：山东德诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37