人肺炎支原体单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人肺炎支原体单克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。本发明专利技术将人肺炎支原体进行培养、浓缩与纯化，获得高纯度的人肺炎支原体，将其免疫接种小鼠后，将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选能够稳定分泌人肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株MP‑H8，其保藏编号为CGMCC No.11287，其分泌的单克隆抗体效价高，可达107，特异性好，亲和力强，亲和常数达到3.92×108L/mol，可用于制备人肺炎支原体含量检测试剂盒和抗体检测试剂盒，也可以用于人肺炎支原体的鉴别诊断，具有广泛的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学领域与疫苗学领域，具体地，涉及一种抗人肺炎支原体单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株以及抗体的应用。
技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasmapneumonia，Mp)是一种结构简单、无细胞壁，呈高度多形性的常见病原体，通过呼吸道传播，儿童感染率较高。肺炎支原体感染除引起肺炎外，还可引起肺外感染，如支气管炎、气管炎、咽炎、扁桃体炎等，还可诱发哮喘。肺炎支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁的抗菌药物如青霉素类、头孢菌素类不敏感，而儿童处于生长发育期，能够用于治疗儿童肺炎支原体感染的药物选择更少。支原体肺炎的临床症状为发热、咳嗽、畏寒、咽部疼痛、厌食、头痛、肺部罗音等，在发病初期常常被误诊，导致病情加重，甚至发展成致死性肺炎。在感染早期，若能准确地检测出肺炎支原体并将之清除，将会大大降低支原体肺炎的爆发率。因此，肺炎支原体的诊断就显得尤为重要。目前人肺炎支原体的诊断检测方法很多，分离培养是诊断肺炎支原体的金标准，但是此方法操作复杂，培养耗时长，营养要求高，分离阳性率低，无法快速早期诊断，不适用于临床，所以一直并不作为检验的常规操作。分子生物学诊断方法对实验室条件和操作人员技术要求较高，不适于广泛应用。酶联免疫吸附法(ELISA)具有简单、快速、结果明确、操作简单等优点，已成为临床及检疫诊断领域发展的一个方向。因此，为了提高检测人肺炎支原体的敏感性和特异性，建立一种快速、简易和特异性好的诊断方法是十分必要的，而制备出特异性强、亲和力高的单克隆抗体是其前提。国内关于人肺炎支原体单克隆抗体的研究较少，鲜有关于人肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株制备的报道，因此，有必要制备一种特异性强、亲和力高的人肺炎支原体单克隆抗体，用于肺炎支原体的快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人肺炎支原体的单克隆抗体，用于人肺炎支原体的检测。本专利技术的另一目的在于提供上述单克隆抗体的应用。为了达到上述目的，专利技术人展开了制备高亲和力抗肺炎支原体抗体的工作。通过对肺炎支原体进行培养，对收获的人肺炎支原体用0.1m2300KD膜包超滤浓缩，并对浓缩液进行蔗糖密度梯度离心，获得了纯度很高的人肺炎支原体蛋白。Lowry法测人肺炎支原体蛋白含量为2.7mg/ml，稀释蛋白浓度至500μg/ml，用于免疫BALB/c小鼠，获得了能够稳定分泌人肺炎支原体单抗的杂交瘤细胞株。本专利技术提供的一种能够稳定、高效分泌人肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株，其为MP-H8，于2015年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为人肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.11287。本专利技术提供了该人肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株MP-H8在制备人肺炎支原体检测试剂盒中的应用。进一步，本专利技术提供了一种人肺炎支原体单克隆抗体，其由保藏编号为CGMCCNo.11287的杂交瘤细胞株分泌获得。具体地，本专利技术采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞融合技术制备抗人肺炎支原体单克隆抗体，步骤如下：(1)人肺炎支原体培养：用含15％～20％小牛血清的精氨酸支原体肉汤培养基培养人肺炎支原体，收获的人肺炎支原体经1:1000～1:2000的甲醛37℃灭活120h；(2)人肺炎支原体纯化：将收获的人肺炎支原体培养液经300KD0.1m2膜包超滤浓缩；蔗糖密度梯度离心浓缩液：用20～30％和50～55％的蔗糖30000r/min离心12～16h，对离心获得的人肺炎支原体用0.01mol/LPBS洗涤脱糖；(3)动物免疫：纯化好的人肺炎支原体反复冻融5～7次后，将蛋白浓度为500μg/mL肺炎支原体与弗氏完全佐剂等体积混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0.2mL/只；(4)加强免疫；首次免疫后的第14天、28天用人肺炎支原体和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0.2mL/只。首次免疫后35天睛框采血，分离血清，ELISA检测血清中的抗体效价，如果抗体效价不低于1：10000，则进行腹腔冲击，将蛋白浓度为500μg/mL的人肺炎支原体注射到BALB/c小鼠腹腔，0.1mL/只；(5)取BALB/c小鼠脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按2:1～5:1的比例混合，于37℃水浴滴加1mLPEG1500；然后缓慢加入10ml～15mL无血清1640培养基终止融合，800～1500r/min离心5min～10min，弃掉上清，加入50mL10％胎牛血清的1640培养基重悬，将细胞悬液加入到96孔细胞培养板，100μL/孔(每孔约有1*105～5*105个细胞)，次日添加HAT培养液，100μL/孔；(6)杂交瘤细胞长到孔底面积的10％～20％左右时，ELISA检测细胞上清的抗体效价，对阳性孔的细胞(ELISA结果大于阴性对照2倍以上)进行2～3次亚克隆。ELISA筛选和人肺炎支原体有明显反应活性的细胞株(ELISA结果大于阴性对照10倍以上)，用于扩大培养建库。将筛选的细胞株扩大到10个175cm2细胞培养瓶，待细胞长到瓶底面积的80％时冻存，冻存密度为1×106～5×106个/mL，1mL/管，共100管，于液氮中长期保存；(7)将冻存的细胞复苏，培养到细胞覆盖瓶底的80％左右时摇下细胞，计数5×106～1×107个/mL，腹腔免疫BALB/c小鼠，0.5mL/只，制备腹水。(8)纯化单抗腹水先经滤纸过滤初步去除杂质，再经0.45μm的微孔滤器过滤，过滤后的腹水经ProteinA层析柱进一步纯化，获得高纯度的单克隆抗体，于-20℃保存备用。更进一步地，本专利技术提供了上述单克隆抗体在制备检测人肺炎支原体试剂盒中的应用。本专利技术提供了上述的单克隆抗体在制备检测人肺炎支原体抗体试剂盒中的应用。本专利技术提供了一种用于检测人肺炎支原体或抗体的试剂盒，含有上述单克隆抗体。对本专利技术的单克隆抗体，经生物标记或化学标记后获得的单克隆抗体也属于本专利技术的保护范围。进一步地，经酶标记的上述单克隆抗体属于本专利技术的保护范围。所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。本专利技术提供了保藏编号为CGMCCNo.11287的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在检测生物样品中人肺炎支原体中的应用。本专利技术提供了保藏编号为CGMCCNo.11287的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备预防人肺炎支原体感染药物中的应用。含有本专利技术所述单克隆抗体的预防或治疗人肺炎支原体的药物属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了保藏编号为CGMCCNo.11287的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在肺炎支原体疫苗制备过程的质量检测中的应用。本专利技术提供的人肺炎支原体单克隆抗体具有如下有益效果：1、本专利技术通过0.1m2300KD膜包超滤人肺炎支原体收获液，可以有效地去除收获液中残留的牛血清，用完整的人肺炎支原体破碎物免疫小鼠，可以获得高效价的单克隆抗体。本专利技术的单克隆抗体具有较高的效价即反应性，间接法效价最高可达107。2、本专利技术的单克隆抗体与人型支原体、解脲支原体等无交叉反应，具有较好的特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.11287。

【技术特征摘要】
2015.11.11 CN 20151076732801.一种人肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.11287。2.权利要求1所述的人肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备人肺炎支原体检测试剂盒中的应用。3.一种人肺炎支原体单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCCNo.11287的杂交瘤细胞株分泌获得。4.权利要求3所述的单克隆抗体在制备检测人肺炎支原体试剂盒中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：童钦，张博，金亚明，陈慧芬，张星星，高强，尹卫东，
申请(专利权)人：北京科兴中维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11