非典型性肺炎病毒特异蛋白质和临床检测的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种非典型性肺炎病毒特异蛋白质和临床检测的方法及试剂盒。它提供了非典型性肺炎病毒特异蛋白质，或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物；并利用该通式蛋白质免疫检测人非典型性肺炎病毒的方法及试剂盒。本发明专利技术解决了临床对非典型性肺炎病毒感染者的早期快速诊断问题，具有较高的准确性，为临床检测本病提供了快速、准确的诊断方法和试剂盒。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人类医学卫生领域，具体地说是一种非典型性肺炎病毒特异蛋白质和临床检测的方法及试剂盒。
技术介绍
非典型性肺炎病毒，即SARS病毒是一种引起严重急性呼吸道疾病综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，又称非典型性肺炎的病毒，属冠状病毒(coronavirus)类病毒，基因组共含29,737个核苷酸。造成感染严重时可致人于死，病死率高达4.9％。主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播。该病毒目前还没有有效的免疫化学检测方法，只能根据临床症状(高热、干咳、肺部X光检测有阴影等)来诊断，受到很大的局限，只能在受感染者发病后才能作出诊断，且不易与其它肺炎和一般流感区别。本专利技术根据该病毒的基因组序列分析结果，选取该病毒特有蛋白质和多肽片断，建立一种检测非典型性肺炎病毒抗体的免疫学方法和含有它们的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种非典型性肺炎病毒特异蛋白质和临床检测的方法及试剂盒。本专利技术采用的技术方案如下1、一种非典型性肺炎病毒特异蛋白质，它包括非典型性肺炎病毒的蛋白质和经修饰的重组非典型性肺炎病毒蛋白质，或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物，具有通式Seq.ID No.--Seq.ID No.118的氨基酸序列的蛋白质。所说的蛋白质相对应的抗体；是单克隆抗体，或是多克隆抗体。2、一种非典型性肺炎病毒特异蛋白质临床检测方法，其具体步骤如下1)制备上述的蛋白质；通过本领域技术人员周知的PCR扩增技术和重组DNA技术，流程见附图1，具体如下A、设计相应的PCR引物，同时在所用PCR引物中添加编码相应数目氨基酸残基对应的碱基，分别从临床非典型性肺炎病毒标准株中扩增编码上述蛋白质的DNA片段；B、将所得PCR产物导入合适的表达载体，构建重组DNA；C、用所得重组DNA转化合适的宿主细胞，在适于目标蛋白质表达的条件下培养如此转化的宿主细胞；D、回收并纯化目标蛋白质；2)用纯化上述的蛋白质或抗体包被一种固相支持物；所说的固相支持物包括本领域周知的有机和无机多聚物，为葡聚糖、天然或经修饰的纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯；或用胶体金的方法包被到试纸上；3)用比色法、分光光度法或荧光法测定的酶标记的蛋白质或抗体，或抗体的第二抗体(IgG、IgM、IgA)；标记酶包括但不局限于氧化还原酶类，为催化酶、过氧化物酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶；碱性磷酸酶；乙酰胆碱酯酶；使用胶体金，或放射性同位素作为标记；4)将待检测个体的生物学样本及由步骤3)标记的蛋白质加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育一段时间；所述的“适合形成抗原抗体免疫复合物的条件”是指在适当的温度及时间条件下孵育抗原与含抗体的样品的混合物，例如在约0-50摄氏度，标记约30分钟至约48小时。5)适度清洗去除任何未结合的非典型性肺炎病毒抗体；所用清洗液一般为pH约5-8的磷酸盐缓冲溶液。6)定量检测孵育混合物中抗原抗体免疫复合物的存在。可采用多种本领域周知的方法定量检测抗原抗体复合物的形成，如以过氧化物溶液为A液及联苯胺类物质为B液的底物与带有含标记的辣根过氧化物酶的抗原抗体免疫复合物作用，显色后在波长为450nm(参比波长630nm)酶标仪读取吸光值；将所得读数与阴性对照的读数加以比较，判断所测样本的结果。3、一种非典型性肺炎病毒特异蛋白质临床检测的试剂盒，包括1)包被有纯化的蛋白质的固相支持物；相应的经标记的的蛋白质和使用该试剂盒的说明(双抗原夹心法)；2)包被有纯化的抗体的固相支持物；相应的经标记的抗体和使用该试剂盒的说明(双抗体夹心法)；3)包被有纯化的蛋白质的固相支持物；相应的第二抗体，该第二抗体是抗IgG抗体和/或抗IgM抗体和使用该试剂盒的说明(Elisa法)。所说的快速检测非典型性肺炎病毒的试纸，是由喷涂过的蛋白或抗体，及喷涂有胶体金的试纸基质粘合而成；在上述检测试剂盒中，经标记的非典型性肺炎病毒蛋白质是液体的形式包装在容器中，或便于重构的冻干物的形式置于的包装中。在后一种情况中，检测试剂盒中还优选含有用于重构经标记的非典型性肺炎病毒蛋白质的缓冲液；在上述检测试剂盒中，还含有提供判断检测结果的相应的范围。本专利技术与
技术介绍
相比具有的有益效果是它解决了临床对非典型性肺炎病毒感染者的早期快速诊断问题，具有较高的准确性，为临床检测本病提供了快速、准确的诊断方法和试剂盒。附图说明图1是将PCR产物与载体连接构建重组DNA示意图；图2是高压液相色谱(HPLC)图。具体实施例方式B、将所得PCR产物导入合适的表达载体，如附图1所示的pET-28质粒，构建重组DNA；1μg的质粒DNA于37℃下经NdeI和XhoI酶完全酶切，酚/氯仿抽提，-20℃下无水乙醇沉淀过夜。离心后沉淀溶于13μl H2O。经过NdeI和XhoI酶充分酶切的PCR产物与上述预酶切的质粒连接。C、用所得重组DNA转化合适的宿主细胞，在适于目标蛋白质表达的条件下培养如此转化的宿主细胞；转化至大肠杆菌ER2566，涂布含有200μg/ml氨苄青霉素的LB选择平板。37℃过夜培养。构建过程参见图1。所述连接及转化的方法和条件参见，J.萨姆布雷奇等著的《分子克隆实验指南》(Molecular CloningA LaboratoryManual)P672-849(科学出版社，1998)从转化平板上挑取抗性菌落，提取质粒并电泳检查，筛选重组子。通过限制性内切酶NdeI和XhoI酶切分析，筛选含有正确插入的目的基因的重组子。对所得含有插入片段的重组质粒测序，确证在PCR过程中目的基因片段未发生变异或出现差错。D、回收并纯化目标蛋白质；将选定的重组子菌株接种于含200μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，置于恒温摇床培养，37℃培养至菌液0D值约0.6后加入1mM IPTG诱导，30℃继续培养2小时。然后将发酵培养物离心收集菌体沉淀。用超声波将所得细菌菌体破碎后再次离心，收集上清液。利用金属镍-Sepharose(Pharmacia公司)的亲和层析柱进行蛋白的分离纯化(洗脱条件0.02M pH7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)，洗脱速度1ml/分钟)。经充分洗涤去除非特异性结合的蛋白质后，分离并收集与金属镍-Sepharose结合的表达蛋白，进行SDS-PAGE电泳和高压液相色谱分析。附图2为经纯化的蛋白质的高压液相色谱图。二、间接法检测非典型性肺炎病毒抗体1)每次试验设空白对照、阴性对照和阳性对照各1孔。空白孔不加液体；阴、阳性对照无需稀释直接取50μl加入阴、阳性对照孔中；其余检测孔加入样品稀释液，每孔100μl，再加入待测样品10μl。充分混匀，贴上封口胶，置37℃温育30分钟。2)将50倍浓缩洗板液用双蒸水50倍稀释后用于洗涤板孔。3)弃去各孔中样品，每孔加满洗液，静置数秒后弃去，重复5次，拍干。4)每孔加入酶标抗人IgG工作液100μl，贴上封口胶。置37℃温育20分钟。5)弃去各孔中液体，用洗板液反复洗涤5次，拍干。6)每孔加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，轻拍混匀，置37℃避光温育10分钟。7)显色完毕后，每孔加入终止液50μl，轻拍混匀，立即以空白孔调零，置酶标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非典型性肺炎病毒特异蛋白质，其特征在于：它包括非典型性肺炎病毒的蛋白质和经修饰的重组非典型性肺炎病毒蛋白质，或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物，具有通式Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１－Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１１８的氨基酸序列的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪建，方健秋，文洁，牟峰，陈唯军，刘斯奇，胡咏武，殷剑宁，王俊，杨焕明，
申请(专利权)人：杭州华大基因研发中心，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]