重组多聚流感蛋白制造技术

本发明专利技术涉及免疫原性组合物，其包含融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的重组多聚流感蛋白或其部分，优选重组三聚流感病毒血凝素和/或重组四聚流感病毒神经氨酸酶，或包含编码此类流感蛋白的核酸序列的载体。本发明专利技术还涉及用于制备此类免疫原性组合物的方法及其用途，以及用于引发个体的免疫应答的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组多聚流感蛋白本专利技术涉及病毒学领域，具体地，本专利技术涉及流感病毒疫苗领域。流感是由属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的三种类型的流感病毒甲型、乙型和丙型流感病毒引起的感染性疾病。流感病毒为由编码9种蛋白质的7个负单链RNA区段(丙型流感)或编码11种蛋白质的8个负单链RNA区段(甲型和乙型流感)组成的RNA 病毒(Chen和Deng，2009)。鸟类被认为是所有甲型流感病毒的天然宿主，但许多亚型也可感染哺乳动物包括人。流感症状包括发热、头痛、恶寒、肌内疼痛和咽喉疼痛，与普通感冒相当的症状。然而，流感可导致威胁生命的并发症例如肺炎，和在高危人群例如幼儿、老年人以及免疫力下降的或患慢性疾病的个体中导致死亡。在过去，流感大流行例如1918/1919 西班牙流感大流行(H1N1亚型)和1968/1969香港流感大流行(H 3N2亚型)已造成数百万人死亡(Khanna等人，2008)。流感病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)为血清学上不同的流感亚型的基础。目前已鉴定了 16种HA(H1-H16)和9种NA(N1_N9)血清型，其用于分类流感病毒(例如H3N2)。抗原漂移(由引起氨基酸置换的一个或多个突变导致)，可引起HA和NA的小的抗原改变，从而导致逃脱宿主的免疫。此外，称为抗原转变的过程通过来自不同流感病毒亚型的HA和NA的组合导致形成新的病毒亚型(重排列)。HA和/或NA的这些改变部分可以为选择压力的结果(Chen和Deng, 2009)。HA存在于病毒膜中。其必须被宿主蛋白酶切割，产生两条多肽HAl和HA2，才能具有感染性。在切割后，HA2多肽的新暴露的N末端随后用于介导病毒与宿主细胞膜的融合， 这使得病毒能够起始对宿主细胞的感染(Skehel和Wiley，2000)。HA为由3个结构上不同的区域(由包含受体结合位点和和HA1/HA2切割位点的反向平行β-折叠组成的球状头部、三链卷曲螺旋(coiled-coil) α螺旋茎、和由反向平行β -折叠组成的球状脚)组成的同三聚体。图I中展示了流感病毒的示意图。每一个单体由具有通过二硫键连接的HAl和 ΗΑ2 区域的 HA 多肽组成(Skehel 和 Wiley, 2000; Stevens 等人，2006)。NA催化宿主细胞的糖蛋白的末端唾液酸残基的水解，从而阻止HA与此类蛋白质的结合。因此NA促进病毒从细胞释放,从而促进病毒的扩散。NA为通过N端锚定至病毒膜的同四聚体。在图I中，显示了流感病毒的示意图。每一个单体包含以螺旋浆形式排列的6个拓扑学上一致的β_折叠，这形成了连接至茎区域的四聚体蛋白的头部。酶活性位于每一个单体中(Colman 1994)。流感病毒感染在冬天最盛行，每年都开发季节性流感疫苗。此类疫苗包含两种甲型流感病毒(Η1Ν1和Η3Ν2)和一种乙型流感病毒(Khanna等人，2008)。每年都需要开发新型组合物来保护免受预测的循环株(circulating strain)的侵害。尽管它们可具有高同源性，特定疫苗可能不能保护免受相同甲型流感亚型的不同株的侵害。除了季节性人流感疫苗外，存在几种用于治疗动物的流感疫苗，例如抗家禽的禽H5N1和H9N2流感感染的疫苗和抗猪的HlNl和H3N2流感感染的疫苗。目前可获得的流感疫苗为活减毒流感病毒或灭活的流感病毒，其通常通过在含胚鸡卵(embryonized chicken egg)中生长病毒来产生。该生产方法存在几个不利方面，包括操作流感病毒所需的高水平生物安全防范设施，不能在含胚鸡卵中获得高产率的流感病毒，对于非常有限数目的甲型流感亚型的高度特异性以及不能在蛋类过敏的个体(主要是儿童)中使用疫苗(Lipatov等人，2004)。已作出许多努力来开发基于来源于HA或NA的重组蛋白质的疫苗。然而，所有此类疫苗在治疗效率和功效方面具有局限性。Wei等人(JVirol. 2008)描述了利用重组H5N1 HA蛋白接种小鼠。用于表达重组H5N1 HA蛋白的质粒包含编码三聚结构域和His-标签的核酸序列，所述三聚结构域和His-标签在蛋白质纯化后都被去除。为了有效，必须用相对高的量(20 μ g)的蛋白质免疫小鼠超过I次(第O和3周)。在Song等人(PLoS One. 2008) 和TO 2007/103322中，描述了利用2个剂量的包含融合至TLR5配体鞭毛蛋白的HA球状头部的组合物进行的小鼠免疫。此外，在Song等人(PLoS One. 2008)中，利用2个剂量的5 或15 μ g融合至鞭毛蛋白的HA免疫兔子。在Saelens等人(Eur JBiochem. 1999)中，使用 3个剂量的包含毕赤酵母(P.pastoris)中表达的重组HA和Ribi佐剂(水包油乳剂)的组合物来免疫小鼠，W095/18861描述了使用3个剂量的包含神经氨酸酶的组合物免疫小鼠。 Kong等人(Proc Natl Acad Sci USA. 2006)需要利用3个剂量的表达流感病毒血凝素的质粒 DNA 来免疫小鼠，这也描述于 WO 2007/100584、WO 2008/112017 和 WO 2009/092038 中。本专利技术的目的是，提供用于引发抗流感病毒的保护性免疫应答的改进的免疫原性组合物。因此本专利技术提供了免疫原性组合物，其包含至少一种融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白的重组多聚胞外结构域或其部分，以及药学上可接受的稀释剂。“免疫原性组合物”在本文中被定义为，当给个体施用时能够引发免疫应答的组合物。引发的免疫应答可以是体液免疫应答、细胞免疫应答或其组合，包括但不限于抗体、B细胞和T细胞的产生。本文中使用的免疫应答优选特异性针对根据本专利技术的组合物中的一种或多种免疫原。可通过本领域已知的任何技术给个体施用本专利技术的免疫原性组合物，所述技术包括但不限于肌内(IM)、真皮内(ID)、皮下(SC)、颅内(1C)、腹膜内(IP)或静脉内(IV)注射、 经皮肤、口服、鼻内或直肠施用，及其组合。此外，可以例如通过注射或口服或经鼻施用单个地,或例如通过补充入饮用水或通过对动物喷雾或喷雾至动物例如农场动物上方的空气中集体地进行根据本专利技术的免疫原性组合物的施用。在优选实施方案中，根据本专利技术的免疫原性组合物用于引发免疫应答。优选将免疫原性组合物用作疫苗。“个体”在本文中定义为人或动物，优选可被流感病毒感染的动物，例如鸟类，包括但不限于家禽。个体包括但不限于鸡、鸭、鹅、火鸡、天鹅、鸸鹋、珠鸡(guinea fowl)和雉、 人、猪、白鼬、海豹、兔、猫、狗和马。在本专利技术的优选实施方案中，个体为哺乳动物例如人、猪或马，或鸟类。在本专利技术的一个实施方案中，所述哺乳动物为人。“多聚胞外结构域”在本文中定义为，表面蛋白质的细胞外部分，所述表面蛋白包含至少两个(非共价键合的)亚基。所述表面蛋白可以为流感病毒的任何表面蛋白。通过使用流感病毒表面蛋白的多聚胞外结构域或其部分，获得和/保持所述流感病毒表面蛋白的正确二级、三级和四级结构。“流感蛋白质”在本文中定义为由流感病毒基因组编码的任何蛋白质。本文中使用的“药学上可接受的稀释剂”定义为，不具有生物学或另外的不想要的活性的任何溶液、物质或其组合，意味着可将其与免疫组合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·J·M·罗特尔，B·J·博世，C·A·M·德汉，
申请(专利权)人：乌得勒支大学控股有限责任公司，
类型：
国别省市：