通用病毒样颗粒(VLP)流感疫苗制造技术

在此描述了流感病毒样颗粒(VLP)，它们在其表面上展示出一种或多种截短、重新工程化或重塑的HA分子。还描述了制造和使用这些VLP的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通用病毒样颗粒(VLP)流感疫苗相关申请的交叉引用本申请要求均于2010年2月18日提交的美国临时申请号61/305,768和61/305,759，其披露内容通过引用结合在此。关于联邦资助的研究的声明不适用。
在此描述了包含抗原性流感蛋白的病毒样颗粒(VLP)，以及制造和使用这些VLP的方法。
技术介绍
流感病毒(甲型、乙型以及丙型)是人类以及其他哺乳动物以及鸟类中的呼吸道感染的致病因子。病毒生命周期中的独特的生物学以及流行病学特征驱使新病毒株的快速抗原进化和不断出现，特别是甲型病毒的新病毒株。抗原变体的这种不断出现导致了季节性流感流行以及以不规则间隔的全球大流行。每年的流感流行仅在美国就造成大约36,000人死亡，并且每年全世界的死亡人数超过250,000，同时造成了巨大的健康和经济负担。流感大流行对于人类的健康造成了严重威胁，并且像1918年大流行这样的全球事件造成了据估计5千万例的死亡以及破坏性的社会经济影响。流感病毒具有单链、分段的RNA基因组，并且是正粘病毒科的成员。甲型流感病毒在病毒颗粒的表面上展示两种主要糖蛋白，即血凝素(HA)以及神经氨酸酶(NA)，并且基于这两种分子的抗原特性，它们被分成16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。流感病毒感染之后的主要免疫应答靶向表面糖蛋白HA和NA。针对HA的抗体能够阻断病毒结合至细胞表面受体，并防止病毒进入和感染。然而，随着时间的过去，这种应答变得无效，并且不能针对由于抗原性漂移(突变的积累)或者抗原性转变(由于重配造成的交换片段)而引起出现抗原变体进行保护。目前，用于控制季节性或大流行性流感疾病的一种最有效的干预是预防接种。这种实践要求易感受试者每年接收一定剂量的用最近的人病毒分离物配制的疫苗。这样的疫苗通常由单独的病毒制备，每一种病毒在鸡胚中或者培养细胞中生长，并且然后混合于最终疫苗制剂中以便提供较宽的覆盖范围。由于流感病毒的快速抗原变异，疫苗必须定期重新配制以便结合出现的抗原变体，从而维持疫苗保护效力。因此，疫苗的有效性取决于疫苗与人体内循环的病毒株之间的抗原相似性程度。此外，一定比例的接种个体，包括老年人，在使用当前疫苗的情况下不能产生保护性免疫。最近用噬菌体展示抗体文库进行的一项研究已经鉴定出广泛中和性抗体，它们能够阻断广谱的流感病毒亚型导致的感染(JianhuaSui等人(2009)Nat.Structural&Mol.Biol.16:265-273)。这些抗体中和光谱的病毒的能力由以下作用产生：与HA分子的干区中存在的亚优势并且高度保守的表位反应，通过抑制膜融合而不是通过阻止由于病毒感染或接种诱导的主要中和机制的受体结合来阻断感染。对展显示了这些亚优势并且高度保守的表位的疫苗的设计将引出能够针对广谱的流感亚型进行保护的广泛中和性免疫应答。为了产生用于配制目前疫苗所需要的病毒组分，所选择的病毒通过感染鸡胚或培养细胞而生长。这个过程取决于病毒的经由HA分子附着至细胞表面上的含有唾液酸的受体的能力、侵入、病毒复制以及病毒子代从鸡胚或培养细胞的液体中的分离。将病毒HA截短、重新工程化或重塑将消除受体结合并且排除病毒复制并且产生这样一种疫苗。通过同时表达2种、3种或4种病毒基因(M1、M2、HA以及NA)来产生流感VLP，其中M1、M2或(类似基质蛋白)HA以及NA是该结构的主要和基本组分。参见例如美国专利公开号20080031895和20090022762。编码这些基因的DNA序列同时或依次转染至细胞中，在细胞中它们被转录并且翻译成它们对应的蛋白质，这些蛋白质自组装成病毒样颗粒。与病毒相反，针对受体结合和病毒侵入的HA区域的修饰并不干扰VLP在细胞中的产生、组装或释放。也就是说，VLP的产生允许带有分子的免疫优势和遗传可变区的HA的主要部分的缺失和重塑，而病毒复制方法并不允许这些修饰。也可以在NA分子上引入相似的修饰，该NA分子也展示在VLP疫苗的表面上。然而，对于流感疫苗组合物以及制造和使用这类组合物的方法仍然存在着需要。
技术实现思路
在此描述了包含至少一个截短的和/或杂合流感抗原蛋白(例如HA或NA)的病毒样颗粒(VLP)。还描述了包含这些VLP的组合物，以及制造和使用这些VLP的方法。在此描述的VLP没有病毒遗传物质，并且因此不会复制或导致感染；然而在假定它们与野生型病毒粒子的形态、生物化学以及抗原相似性的情况下，VLP具有高度免疫原性，并且能够引出强烈的保护性免疫应答。不同于基于病毒粒子灭活的疫苗，VLP不具有传染性，由此消除了化学处理的需要，因而保留了天然构象。此外，本专利技术通过提供针对当前的以及演化的流感病毒的广泛保护，克服了与每个季节重新配制流感疫苗相关的问题。因此，在一方面，在此披露的是一种病毒样颗粒(VLP)，该病毒样颗粒包括在此提供的包含至少一种基质蛋白(例如流感基质蛋白如M1、托高土(thogoto)基质蛋白以及RSV基质蛋白)；以及修饰的流感多肽(例如糖蛋白如HA或NA)的病毒样颗粒(VLP)，其中该修饰包括流感(例如HA)多肽的跨膜以及胞质尾区外部的一个或多个氨基酸残基的缺失。在某些实施方案中，缺失包括至少150个连续氨基酸残基的缺失。在其他实施方案中，缺失包括一个以上的非连续缺失。仍然在其他实施方案中，流感多肽(例如HA)包含一个或多个氨基酸突变(置换和/或添加)，例如其中至少一个溶蛋白性裂解位点和/或至少一个连接物被插入修饰的流感多肽(例如HA)中的实施方案。该连接子可以是已知的连接序列，或者可以从头产生以用于在此描述的分子中。在此处披露的任何VLP中，VLP可以是多价的，即可以包含多种流感抗原蛋白，包括在此描述的野生型和/或修饰的流感多肽的任何组合。另外，在此处描述的任何VLP中，修饰的流感(例如HA或NA)多肽的跨膜和/或胞浆区被替换为来自与修饰的流感多肽不同的毒株或亚型的跨膜和/或胞浆区。此外，在此描述的任何VLP可以进一步包含另外的流感蛋白，例如一种或多种另外的野生型基质蛋白(M1和/或M2)、一种或多种另外的修饰的(突变和/或杂合)基质蛋白(M1和/或M2)、一种或多种野生型抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一种或多种杂合抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一种或多种修饰的抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一种或多种杂合并修饰的抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一种或多种核蛋白(NPs)、一种或多种PB1蛋白、一种或多种PB2蛋白、一种或多种PA蛋白以及它们的组合。在某些实施方案中，VLP的多价性在于一种以上抗原性糖蛋白(修饰的糖蛋白或野生型糖蛋白的任何组合)表达在VLP的表面上(例如以便产生免疫应答)。在此描述的任何VLP可以在允许VLP组装和释放的条件下表达在真核细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)中。在另一方面，在此描述的是包含以上描述的任何VLP的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞允许在此描述的VLP在编码VLP多肽的一种或多种载体中的组装以及从其释放。在某些实施方案中，真核细胞选自下组，该组由以下各项组成：酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在又一方面，在此提供产生在此描述的任何VLP的方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.18 US 61/305,768;2010.02.18 US 61/305,7591.一种病毒样颗粒VLP，包含流感M1蛋白和M2蛋白；以及一种修饰的流感HA多肽，其中该修饰的流感HA多肽选自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10所组成的组。2.如权利要求1所述的VLP，其中该VLP在允许VLP的组装以及释放的条件下在一种真核细胞中表达。3.如权利要求2所述的VLP，其中该真核细胞选自下组，该组由以下各项组成：酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。4.一种产生根据权利要求1至3中任一项所述的VLP的方法，该方法包括以下步骤：将一种或多种载体转染至适合的宿主细胞中，并且在允许形成VLP的条件下表达蛋白质的组合，所述一种或多种载体包括编码以下物质的序列：流感M1蛋白和M2蛋白，以及选自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔斯·加拉尔萨，乔治·R·马丁，
申请(专利权)人：泰科诺瓦有限公司，
类型：
国别省市：