包含与植物病毒衣壳蛋白融合的靶蛋白的病毒样颗粒制造技术

提供了包含融合蛋白并且基本不含核酸的病毒样颗粒，其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白。包含该病毒样颗粒的免疫原性组合物可以被施用给受试者以在受试者中引起保护性免疫应答。还提供了产生该病样颗粒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体涉及重组疫苗领域。更具体地说，本 专利技术涉及用于疫苗中的、包含与植物病毒衣壳蛋白融合的靶蛋白的病毒样颗粒，以及产生该病毒样颗粒的方法。
技术介绍
植物病毒是抗原产生和递送的有效工具。多种重要的蛋白抗原已经在转基因植物中表达，但产生的抗原蛋白水平相对较低。为试图解决这个问题，已设计了植物病毒衣壳蛋白来用作融合抗原多肽的载体分子并用于瞬时表达系统中。衣壳蛋白有自装配并形成重组病毒颗粒的能力，所述重组病毒颗粒在其表面展示理想的抗原表位或外来多肽。由于重组病毒在细胞质中复制，理想的抗原表位或外来多肽可能因为在翻译后水平修饰不足或不正确的折叠而不能被正确的展示。由重组烟草花叶病毒(TMVs)或豇豆花叶病毒感染而在植物中产生的抗原，在注入小鼠中时已经显示能诱导特异性抗体。然而，在这些系统中，当长度大于25个氨基酸的多肽与其衣壳蛋白融合时，病毒不能装配。在不同的系统中，长至47个氨基酸的多肽与苜蓿花叶病毒(AIMV)衣壳蛋白的融合没有阻碍病毒装配，而得到的包含病毒核酸的病毒颗粒是有效的免疫原(Yusibov，V·，et al. ,PNAS 94 :5784_5788，1997)。最近，已经开发出了一种方法使用一 15个氨基酸的连接肽，将蛋白A的功能性片段(133个氨基酸)附加到TMV衣壳蛋白的C末端。得到的病毒结构可以装配成能感染叶组织并在组织中移动的病毒颗粒(Werner, S.，et al. ,PNAS 103 :17678-17683，2006)。然而，所有这些系统都得到含病毒RNA的感染性病毒颗粒。使用这样的颗粒诱导保护性免疫应答，即作为疫苗，将会使受试者接种病毒的RNA以及预定的免疫原。仍然有对在病毒样颗粒的表面展示理想的抗原表位或外来多肽的免疫方法和材料的需求，其中病毒样颗粒基本不含病毒核酸。专利技术概述本专利技术公开的主题提供了病毒样颗粒以及使用和制备该病毒样颗粒的方法。根据本专利技术的一个方面，提供了病毒样颗粒。病毒样颗粒包含融合蛋白并基本不含核酸，其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白。病毒样颗粒可以在选自由细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物细胞组成的组的宿主细胞中产生。靶蛋白可以融合到植物病毒衣壳蛋白的N末端。植物病毒衣壳蛋白可以源自选自由苜蓿花叶病毒，高粱花叶病毒和马铃薯Y病毒组成的组的植物病毒的衣壳蛋白。靶蛋白可以源自细胞内病原体的多肽。靶蛋白可以源自恶性疟原虫的细胞表面多肽或流感病毒的血凝素多肽。流感病毒可以是选自由HlNl、H3N2、H5N1、和H7N7组成的组的A型流感病毒。流感病毒也可以是B型流感病毒。靶蛋白可以包含选自由SEQ ID NOs 4-11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。根据本专利技术另一个方面，提供了免疫原性组合物。免疫原性组合物包含病毒样颗粒。免疫原性组合物进一步包含佐剂。佐剂可以选自由铝盐、油水乳剂和基于皂苷的佐剂组成的组。在某些实施方案中，植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白，而靶蛋白包含选自由SEQ ID NOs 4-11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。提供了在受试者中引起对细胞内病原体的保护性免疫应答的方法。该方法包含给受试者施用免疫有效量的包含第一病毒样颗粒的第一组合物，其中第一病毒样颗粒包含第一融合蛋白并基本不含核酸，其中第一融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和源自第一细胞内病原体的第一靶蛋白。在某些实施方案中，植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白，而第一靶蛋白包含选自由SEQ ID NOs :4-11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，组合物进一步包含佐剂。 该方法进一步包含在施用第一组合物之前给受试者施用免疫有效量的包含第二病毒样颗粒的第二组合物，其中第二病毒样颗粒包含第二融合蛋白并基本不含核酸，其中第二融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和第二靶蛋白。第二靶蛋白可以源自不是第一细胞内病原体的第二细胞内病原体。在某些实施方案中，第一靶细胞内病原体可以是流感病毒，植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白，第一靶蛋白包含选自SEQ ID NOs :6-11组成的组的氨基酸序列，而第二靶蛋白包含选自SEQ ID NOs :4、5和49组成的组的氨基酸序列。特别是，第一和第二靶蛋白可以分别包含SEQ ID NOs 6和4的氨基酸序列。还提供了在包含编码融合蛋白的核苷酸序列的宿主细胞中产生病毒样颗粒的方法，其中病毒样颗粒包含融合蛋白并基本不含核酸，而融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白。该方法包含在允许宿主细胞内病毒样颗粒装配的条件下在宿主细胞中表达融合蛋白。该方法进一步包含从宿主细胞中纯化病毒样颗粒。在某些实施方案中，宿主细胞为选自由细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物细胞组成的组的细胞。当宿主细胞是植物细胞时，方法可以进一步包含使用能够感染植物细胞的重组细菌感染植物细胞，其中该重组细菌包含编码融合蛋白的核苷酸序列。在某些其他实施方案中，靶蛋白源自细胞内病原体。在另外某些其他实施方案中，植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白，而靶蛋白包含选自SEQ ID NOs 4-11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。附图简述图I示意性说明了植物病毒衣壳蛋白与靶蛋白融合以及融合蛋白自装配成病毒样颗粒。图2显示了(A)包含融合蛋白(CP融合构建体)和信号序列(PRla)的示例性基因构建体；(B)将CP融合构建体克隆进表达载体PGR-D4 ;和(C)将CP融合构建体克隆进表达载体pBI121。RB和LB代表通过重组农杆菌导入植物细胞的区域的右和左边界。图3显示了恶性疟原虫Pfs25(上栏)、Pfs28(中栏)、或流感病毒HA3A靶蛋白(下栏)与AIMV衣壳蛋白融合蛋白组成的病毒样颗粒的透射电镜图。病毒样颗粒被负染(左栏)，和使用以免疫金标记的、分别对每种靶蛋白特异的抗体进行标记(右栏)。如标示，t匕例尺=IOOnm 或 200nm。图4A和4B显示了纯化的(A)Pfs25或⑶HA3A与AMV衣壳蛋白融合成的融合蛋白的免疫印迹。每个印迹的右半部分是与抗AIMV抗体孵育。每个印迹的左半部分是与抗(A)Pfs25或⑶HA3A的单克隆抗体孵育。图4C是包含与全长血凝素HAA靶蛋白融合的AIMV衣壳蛋白的植物蛋白粗提物的免疫印迹，所述植物蛋白在不同条件下提取以评价溶解性。印迹是与抗-HAA单克隆抗体进行反应。TSP=总可溶蛋白；TSP-T = Triton提取可溶蛋白；TP =总蛋白。图5Α显示了使用含HA3A_CPF(CPF指“衣壳蛋白融合物”)的VLPs，有或没有佐剂，QUIL A 或ALHYDR0GEL ，或有QUILA 的HAAl免疫28或56天后，小鼠血清样品中抗-A/安徽/1/05的IgG反应。图5B显示了来自与图5A相同小鼠的血清样品中的血清血凝抑制(HI)的抗体反应。 图6显示了使用含Pf S25-CPF或Pf S28-CPF的VLPs，有或没有佐剂，QUIL A 或ALHYDR0GEL ,免疫56天后，小鼠中收集到的血清样品的IgG滴度。图7显示了使用HAI3-CPF VLPs或HAII，有或没有ALHYDR0GEL ，或者单独的CP，免疫35天后，小鼠中收集到的血清样品的抗-A/印度尼西亚/5/0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.18 US 61/243,774;2010.05.25 US 61/348,0691.包含融合蛋白的病毒样颗粒，其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白，而且其中病毒样颗粒基本不含核酸。2.权利要求I的病毒样颗粒，其中植物病毒衣壳蛋白源自选自由苜蓿花叶病毒、高粱花叶病毒和马铃薯Y病毒组成的组的植物病毒的衣壳蛋白。3.权利要求I的病毒样颗粒，其中靶蛋白源自细胞内病原体的细胞表面多肽。4.权利要求I的病毒样颗粒，其中靶蛋白源自恶性疟原虫的细胞表面多肽。5.权利要求I的病毒样颗粒，其中靶蛋白源自流感病毒的血凝素多肽。6.权利要求5的病毒样颗粒，其中流感病毒是选自由H1N1、H3N2、H5N1和H7N7组成的组的A型流感病毒。7.权利要求5的病毒样颗粒，其中流感病毒是B型流感病毒。8.权利要求I的病毒样颗粒，其中靶蛋白包含选自由SEQID NOs :4_11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。9.权利要求I的病毒样颗粒，其中靶蛋白融合到植物病毒衣壳蛋白的N末端。10.权利要求I的病毒样颗粒，其中病毒样颗粒在选自由细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物细胞组成的组的宿主细胞中产生。11.包含病毒样颗粒的免疫原性组合物，其中病毒样颗粒包含融合蛋白并基本不含核酸，其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白。12.权利要求11的免疫原性组合物,进ー步包含佐剂。13.权利要求12的免疫原性组合物，其中佐剂选自由铝盐、油水乳剂和基于皂苷的佐剂组成的组。14.权利要求11的免疫原性组合物，其中植物病毒衣壳蛋白源自选自由苜蓿花叶病毒、高粱花叶病毒和马铃薯Y病毒组成的组的植物病毒的衣壳蛋白。15.权利要求11的免疫原性组合物,其中靶蛋白源自细胞内病原体。16.权利要求11的免疫原性组合物，其中靶蛋白源自恶性疟原虫的细胞表面多肽或流感病毒的血凝素多肽。17.权利要求11的免疫原性组合物，其中植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白，而靶蛋白包含选自由SEQ ID NOs :...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·玉斯博夫，C·E·法兰斯，K·A·穆斯查克，维迪姆·梅特，维兰帝纳·梅特，
申请(专利权)人：弗劳恩霍费尔美国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：