本发明专利技术涉及表达马－２型流感病毒血凝素（ＨＡ１）基因的ＤＮＡ疫苗。通过工程化ＨＡ１内的终止密码子确保ＨＡ１表达。通过将ＤＮＡ疫苗包囊在脂质体中并通过鼻内接种，与表达全长ＨＡ基因的ＤＮＡ疫苗相比，在显著更低的剂量足以引起保护性免疫。更低剂量降低诱导抗ＤＮＡ抗体的风险。直接鼻内接种到呼吸道上皮细胞降低ＤＮＡ整合的风险。本发明专利技术疫苗具有超过当前灭活或减毒活疫苗的优点，因为疫苗的更新只要求用新病毒替换编码序列。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达马-2型流感病毒HA1的DNA疫苗 专利技术背景
本专利技术涉及马流感病毒的疫苗，更具体的，涉及含马2型流感病毒的HA1编码序列的DNA疫苗，所述疫苗可以鼻内给予比典型剂量更低的剂量，而仍引起良好粘膜免疫。背景：马流感病毒(EIV)是马上呼吸道感染的首要致病剂。它已经被认为是几个世纪来马呼吸道疾病流行性爆发的原因。该病毒传播迅速且发病率极高。感染马出现典型“流感”症状：快速发作呼吸窘迫、咳嗽、发热和粘液流出。在罕见情况下，由于继发性细菌性支气管肺炎导致死亡。尽管死亡率低，马流感病毒感染的影响是显著的。估计在1992年香港爆发中暂停赛马导致1亿2千万美元的收入损失。其它马术运动的经济学重要性可能较低，但马流感爆发几次中断国际马术赛事。没有临床体征但经历勤奋训练的感染马可能要忍受长期后果如肺功能降低。临床疾病的马要忍受丧失培训时间的明显缺点。马流感病毒是甲型流感病毒，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员。病毒基因组由八段负链RNA组成。病毒衣壳包裹在脂质包膜内，包膜上锚定两个表面病毒糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA被认为是EIV最具有抗原性的病毒蛋白。HA分子量约77kD。该病毒蛋白合成为HA0，并经蛋白酶作用切割，随后还原单个二硫键成氨基末端HA1部分(50kD)和羧基末端HA2部分(27kD)。HA2部分锚定于膜的脂双层上，而HA1部分通过非共价键结合到HA2上。血凝素参与结合病毒到宿主细胞膜上的受体，导致随后病毒穿透和脱壳，从而启动病毒复制。疫苗接种的主要目的是诱导针对这种病毒编码分子的免疫。有两种马流感病毒亚型。1型或马-1型流感病毒(H7N7)，最近15年已经没有在发达国家中分离到。然而，马-2型流感病毒(H3N8)连续在世界流行，尽管有大量疫苗接种计划。H3N8病毒的成功可能是由于抗原性漂移：通过氨基酸替换连续变化HA的抗原性[1]。最近-->分离的马-2型流感病毒可分类成“美洲”谱系或“欧亚”谱系。另外，更近的马-2型流感病毒已经分叉成多个谱系[2]，并且至少在北美，两个进化谱系隔年流行[3]。当前的EIV疫苗一般由福尔马林或β-丙内酯灭活的完整病毒组成。抗原性组分由马流感病毒1型和2型组成。A/Eq/Prague/56是唯一的1型疫苗株，而2型组分是原型A/Eq/Miami/63和更晚的毒株如A/Eq/Kentucky/81或A/Eq/Fontainebleau/79。最近的WHO/OIE控制马流感协商会议肯定了较早的推荐方案，其中疫苗应包括“美洲”病毒(A/Eq/Kentucky/94)和“欧亚”病毒(A/Eq/Newmarket/2/93)，并且应该中断原型(A/Eq/Miami/63)[4]。在最近的前瞻性研究中，Morley等人[5]已经表明当前的商业疫苗不防止病毒感染，而仅有少量的抑制临床症状的作用。当前商业疫苗的保护性缺乏是由于一个或多个以下因素的组合：-缺乏免疫原性；-疫苗株选择差；和/或-引起不适当的免疫。马-2型流感病毒(H3N8)的连续进化要求定期更新疫苗株以诱发保护性免疫。然而，在不同疫苗制造商中间有广泛的疫苗株选择谱。由于氨基酸替换(抗原性漂移)的一个结果即HA抗原性的改变由早期EIV产生的免疫将不能预防后期分离株。病毒的这种特性是”fail-proof”有效疫苗的主要障碍。已经推荐通过用更近的病毒株替换和以更频繁的间隔来更新疫苗[6]。一些制造商仍在其产品中保留过时的病毒株。尽管特异性针对马流感病毒的抗体仍可被诱导，然而这些疫苗是有问题的。首先，血清抗体水平不是好的保护指标。其次，因为流行病毒株与疫苗株足够不同，它们有最小的交叉活性。由这种过时疫苗诱发的“部分”免疫使受感染宿主成为无症状携带者，也就是说，宿主被感染，但因为部分免疫而使临床症状被抑制。这些受感染宿主不被识别，这有助于病毒的扩散。流感病毒通过附着于呼吸道的纤毛上皮细胞而启动感染。因此，粘膜抗体提供对病毒的有效防御。实际上，认识到鼻抗体在预防马流感病毒中的重要性已经有很多年。在小鼠模型中，已经表明转移IgA提供抗流感病毒感染的保护[7]。-->尽管当前的疫苗诱导血清抗体，却没有目标粘膜免疫。由于缺乏针对抗原和抗体的标准化测量方法，血清抗体水平和疫苗功效的相关性不清楚[8]。 *****几种策略，包括使用免疫刺激复合物(ISCOM)[9]、以及通过直接接种到粘膜区[10]，已经用于加强对当前马流感疫苗的粘膜免疫应答。然而，结果显示使用这些策略只有很有限的改善。基于重组冷适应(温度敏感突变体)和减毒马流感病毒，近来批准的Heska Corp.(Fort Collins，Colorado)的疫苗是诱发粘膜免疫的一个尝试。所述疫苗通过鼻内接种以诱发粘膜免疫。直接鼻内接种冷适应的减毒病毒到粘膜位点提供对粘膜相关淋巴组织(MALT)的强烈刺激。因此这种疫苗是高度免疫原性的并诱发粘膜免疫。然而，因为该疫苗基于通过再分配而得的重组病毒，更新疫苗要求再次工程化冷适应的减毒病毒。在更新疫苗被许可之前不得不进行所有必需的安全和效能测试。DNA疫苗或遗传免疫领域是快速出现的技术。这是一个偶然发现，当含蛋白质编码序列的DNA质粒肌肉注射给小鼠时，不仅表达抗原，而且针对该抗原的免疫应答也被诱发[11，12]。已经相信细胞以和体外DNA转染相似的方式体内摄入DNA质粒。所述DNA质粒不在宿主细胞内复制但编码的抗原被宿主细胞转录并翻译。所述抗原也表达在细胞表面或分泌，并诱发免疫应答[13]。这种新免疫方法已经被很多研究人员显示为有效，并且可用于宽范围的感染性物质，通常包括流感病毒[14]，并特异性针对马流感病毒[15]。已经表明表达A/Eq/Kentucky/81的HA基因的DNA疫苗在通过皮肤和粘膜给予后保护马免受同源病毒侵袭[15]。在专利领域，抗EIV的疫苗和方法在以下美国专利中描述：6,482,414；6,436,408；6,398,774；6,177,082；6,045,790；4,920,213；4,693,893；4,689,224；4,683,137；4,631,191；和4,619,827，所有这些都在此引作参考。美国专利4,920,213和4,631,191涉及免疫马抵抗马流感病毒的重组疫苗。编码来自两株的HA和HN糖蛋白的DNA序列被用于构建牛痘携带的疫苗，设计合成肽用于激发和加强给药，并允许重组合成HA和/或NA蛋白基的疫苗。-->通过解决当前疫苗的以上缺陷，马流感病毒的理想疫苗应该具有高度免疫原性，诱发粘膜免疫，并可易于“更新”。
技术实现思路
本专利技术基于以下发现，当鼻内给予时含马-2型流感病毒HA糖蛋白的HA1片段编码序列的DNA疫苗可提供保护性免疫。表达HA1的DNA疫苗被包囊在脂质体载体中并接种到Balb/c小鼠的鼻腔。两次加强免疫后，用亚致死剂量的传染性同源病毒侵袭小鼠。对于非免疫对照组，观察到7.9％最大体重丧失。对于DNA疫苗免疫组和阳性对照组(用灭活的同源病毒免疫)，观察到的体重丧本文档来自技高网...
【技术保护点】
马流感病毒疫苗，其中含有有效免疫量的分离ＤＮＡ和药理学可接受的载体或稀释剂，所述分离ＤＮＡ含有马－２型流感病毒株的ＨＡ１编码序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2003-5-15 60/470,8431.马流感病毒疫苗，其中含有有效免疫量的分离DNA和药理学可接受的载体或稀释剂，所述分离DNA含有马-2型流感病毒株的HA1编码序列。2.根据权利要求1的疫苗，其中HA1编码序列选自以下毒株：A/Eq/Kentucky/98，A/Eq/Miami/63，A/Eq/Kentucky/81，A/Eq/Fontainebleau/79，A/Eq/Kentucky/94，A/Eq/Newmarket/2/93，A/Eq/New York/99，和A/Eq/Oklahoma/2000。3.根据权利要求1的疫苗，其中HA1编码序列是用于A/Eq/Kentucky/98毒株的。4.根据权利要求1的疫苗，其中HA1编码序列含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。5.根据权利要求1的疫苗，其中还含有其它抗原性成分、其它抗原性成分的编码序列和其它疫苗中的一种或多种。6.根据权利要求1的疫苗，其中还含有用于包含HA1编码序列的载体。7.根据权利要求6的疫苗，其中所述载体是真核表达载体。8...
【专利技术属性】
技术研发人员：A赖，
申请(专利权)人：俄克拉荷马州大学评议会，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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