甲型流感病毒核衣壳蛋白的抗原表位及其用途制造技术

本发明专利技术涉及甲型流感病毒核衣壳蛋白的保守表位多肽及其用途。具体而言，本发明专利技术提供了甲型流感病毒核衣壳蛋白的保守表位多肽，及其保守性变异体或活性片段，及其相关编码序列，其融合蛋白或偶联物，及应用该多肽于预防或诊断的用途，本发明专利技术还提供特异识别该保守表位多肽的抗体，及其用于诊断或治疗甲型流感病毒感染的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及甲型流感病毒感染的检测和/或治疗，属于生物医药工程

技术介绍
流行性感冒(Influenza)简称流感，是由流感病毒引起的呼吸道传染病，其临床特点是引起发热、乏力、全身酸痛及伴随一定程度上的呼吸道症状。流感病毒是人类健康的一大威胁，全世界姆年约有25-50万人死于流感病毒的感染(Peter C. Doherty.等人，JClin Invest，2008，118 :3273-3275)。自从流感病毒被发现以来，人类历史上共出现了五次世界范围内的流感大流行，共计造成了数千万人的死亡。根据病毒核蛋白(NP)及基质蛋 白(M)抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲(KU乙(B)、丙(C)三型(HorimotoT.等人，NAT REV MICROBIOL, 2005, 3 (8) :591-600)。其中，甲型流感病毒(InfluenzaA Virus，简称Flu A)变异快，致病力強，能引起世界范围内的大流行。こ型流感病毒(Influenza B Virus,简称Flu B)变异较慢,只能引起局部范围内的小流行。丙型流感病毒(Influenza C Virus,简称Flu C)变异最慢,致病力弱,通常只能感染抵抗力较低的孕妇和小孩。在自然界中Flu A的宿主范围广，除了其天然宿主水禽以外，还能够引起人、马、猪等多种动物的感染。Flu A亚型多，变异大，已成为流感防控及疫苗研究的重点。Flu A属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、流感病毒属、有包膜的单链负义RNA病毒。其基因组由八条分节段的RNA组成，至少编码十种病毒蛋白。Flu A根据表面抗原血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)抗原性及基因特性的不同又可以分多种亚型，目前在水禽中已发现了十六种H亚型(H1-H16)和九种N亚型(N1-N9) (Fouchier RA.等人,J Virol,2005，79 (5) :2814-2822)。人群中流行的Flu A亚型主要有两种H亚型(HI、H3)和两种N亚型(NI、N2) οFlu A基因片段5编码核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein,简称NP)。NP为Flu A的结构蛋白，由498个氨基酸组成，分子量约为56KD，与病毒RNA及聚合酶形成核糖核蛋白体复合物。NP在病毒粒子中的含量高，约占病毒总蛋白量的30%，每个病毒粒子中约含有1000个NP分子。流感病毒NP的保守性远高于表面膜蛋白HA及NA，同型流感病毒NP的氨基酸同源性高于 90% (AltnmulerA.等人，J Gen Virol，1989，70 :2111-2119)，基因变异率仅为2. 3X10_3/年，具有型特异性，是流感病毒型别划分的主要依据之一，也是动物模型中研究最早的具有交叉保护效果的抗原(Shu L L.等人，J Virol, 1993,67(5) :2723-2729)。因此，NP作为主要的靶抗原用于流感病毒的检测。Flu A感染人后，经呼吸系统的传播速度非常迅速。因此，及时有效的诊断对于FluA的预防及控制有重要意义。人在感染病毒后的36-48小时为最佳治疗时间，因而快速诊断对于患者的及时治疗有积极作用。目前流感病毒的诊断主要有以下三类传统诊断法、分子诊断法及快速诊断法。传统诊断主要有病毒分离培养、血清学检测等。病毒分离培养法是流感病毒诊断的黄金标准(Gold Standard)。这种方法的可信度高，特异性好，但周期较长，通常需要3-7天。因而该方法不利于病毒的现场检测，不利于病毒的及时防控。血清学检测主要是检测病毒人血清中抗体的存在情况。这种检测方法属于回顾性诊断，具有流行病学意义，但对于急性早期诊断意义不大，且敏感度较低。分子诊断法主要是指基于流感病毒核酸诊断的ー类方法，包括常规RT-PCR、real-time PCR及病毒全基因测序等。这些方法周期短、特异性强、灵敏度高，而且能測定病毒不同的亚型。但这些方法对技术及设备的要求极高，不利于病毒的现场检测，不能对大量临床标本同时进行平行检测及筛查。快速诊断是指能够快速地得出检测结果(约30分钟)。快速诊断方法必须符合国际实验室促进协会(Committee for Laboratory Improvement Act, CLIA) 1988 年提出的床边诊断(Point of Care)的要求(Mitamura K.等人，Nippon Rinsho 2003,61 (11)1914-1920 ；Storch GA.等人，CurrOpinPediatr 2003，15 (I) :77-84)。既可以检测流 感病毒的抗原也可以检测抗体。目前国内外已有商品化的流感病毒快速检测试剂盒，如Directigen-Flu A/Flu A&B、Quidel-QuiCkVue 等,都能在 15-30 分钟以内得出检测结果。由于流感病毒中NP的高保守性及高丰度，因而，当前的快速诊断试剂盒的检测靶点都是NP抗原。这些检测方法操作简单、成本低廉、无需特殊设备，适合现场检測。因此，抗原快速诊断试剂已成为广大临床单位进行Flu A诊断的首选。
技术实现思路
本专利技术的ー个方面涉及甲型流感病毒核衣壳蛋白(Flu A NP)的抗原表位多肽，其能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体或者能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合。在ー个具体实施方式中，本专利技术的抗原表位多肽为(a)甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段，其包含SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列至少97%序列一致的氨基酸序列；并且能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体或者能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合。其中，所述抗原表位多肽的长度可以是9-25个氨基酸，例如9-20个氨基酸，例如19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸。在另ー个具体实施方式中，本专利技术的抗原表位多肽为(b)在SEQ IDNO 29所示氨基酸序列的一端或两端经I个或多个(例如I个或几个)氨基酸，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸的延伸和/或在SEQ ID NO :29所示氨基酸序列中经I个或多个(例如I个或几个，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸)氨基酸的置換得到的多肽；并且其能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体或者能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合。在特别的实施方式中，所述经延伸和/或置換后得到的(b)的抗原表位多肽与上述(a)中的抗原表位多肽有至少90%的序列一致性，例如至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在优选的实施方式中，本专利技术的上述(a)或(b)的抗原表位多肽包含SEQ ID NO 17-23或SEQ ID NO :25-29中任一项所示的氨基酸序列，特别地，其由SEQ ID NO :17-23或SEQ ID NO :25-29中任一项所示的氨基酸序列组成，例如由SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列组成。在又ー个方面，本专利技术涉及分离的多肽，其包含上述任一本专利技术的抗原表位多肽。在具体的实施方式中，所述分离的多肽可以是甲型流感病毒核本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的抗原表位多肽，其能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体和/或能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合，所述抗原表位多肽选自：(a)甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段，其包含SEQ？ID？NO：29所示的氨基酸序列或者与SEQ？ID？NO：29所示的氨基酸序列至少97％序列一致的氨基酸序列；或(b)在SEQ？ID？NO：29所示氨基酸序列的一端和/或两端经1个或几个氨基酸，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸的延伸和/或在SEQ？ID？NO：29所示氨基酸序列中经1个或几个，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸的置换而得到的多肽；其中，所述抗原表位多肽的长度可以是9？25个氨基酸，例如9？20个氨基酸，例如19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸。

【技术特征摘要】
1.分离的抗原表位多肽，其能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体和/或能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合，所述抗原表位多肽选自 (a)甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段，其包含SEQID NO :29所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO 29所示的氨基酸序列至少97%序列一致的氨基酸序列；或 (b)在SEQID NO 29所示氨基酸序列的一端和/或两端经I个或几个氨基酸，例如I、2、3、4、5或6个氨基酸的延伸和/或在SEQ ID NO :29所示氨基酸序列中经I个或几个，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸的置换而得到的多肽； 其中，所述抗原表位多肽的长度可以是9-25个氨基酸，例如9-20个氨基酸，例如19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸。2.权利要求I所述的抗原表位多肽，其包含SEQID NO 17-23或SEQID NO 25-29中任一项所示的氨基酸序列。3.权利要求I或2所述的抗原表位多肽，其由SEQID NO 17-23或SEQ ID NO :25-29中任一项所示的氨基酸序列组成。4.分离的多肽，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽；特别地，其为甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段。5.复合物，其包含 (i)权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽或权利要求4所述的分离的多肽；和 ( )载体； 其中所述载体为蛋白、毒素或脂类；其中所述抗原表位多肽与所述载体通过偶联、缀合或融合得到所述复合物；优选地，所述载体为蛋白，例如HBVcAg。6.权利要求5所述的复合物，其为融合蛋白。7.类病毒颗粒，其展示权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽。8.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽、权利要求4中所述的分离的多肽或权利要求6所述的复合物的核酸序列。9.核酸载体，其包含权利要求8所述的分离的核酸分子。10.宿主细胞，其包含权利要求8所述的分离的核酸分子或权利要求9所述的核酸载体。11.药物组合物或诊断组合物，例如疫苗，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈毅歆，桂勋，吴兴容，黄德党，郑清炳，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：