新的流感病毒制造技术

本发明专利技术提供了新的流感病毒，其中的NS和PB1基因节段均被改造过，并且其中的PB1-F2开放读框通过引入至少一个终止密码子而被改造。具体来说，所述流感病毒缺少功能性NS1和PB1-F2蛋白。此外，提供了包含所述经过改造的流感病毒的疫苗制剂及其防止流感感染的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的流感病毒本专利技术提供了新的流感病毒，所述病毒中NS和PBl基因节段均经过改造，并且PB1-F2 ORF被导入了至少一个终止密码子。根据特定实施方案，所述流感病毒缺少功能性NSl和PB1-F2蛋白，在干扰素活性细胞(interferon competent cells)中是复制缺陷的。此外，提供了包含所述改造的流感病毒的疫苗制剂及其预防流感感染的用途。专利技术背景 A型流感病毒是威胁人和动物的最常见病原体之一，甚至可能引起灾难性的大流行。A型流感病毒每年在世界范围内造成300，000-500, 000例死亡，在大流行的年份中，这个数字可能增加到I百万(1957-1958年)或者可能象1918-1919年发生的情况，高达5千万。近年，关于高致病性的禽流感病毒(H5N1)造成大流行的可能性已引起人们的极大关注。1997年香港发生了人体H5N1感染的一次小规模爆发，造成18人被感染和6例死亡，至今共计383例人感染事件，而死亡率达到61 %。已在欧洲获得批准的灭活流感疫苗仅有有限的保护效果，特别是对于老年群体和还未经历过天然流感的幼童来说。冷适应活流感疫苗能够更有效地用于儿童的疾病预防和控制疾病传播，但当前可以利用诸如反向遗传学的新技术来进一步改善活疫苗方法。目前的减毒活疫苗的概念基于产生适应在25°C生长(冷适应)的温度敏感的、减毒的“主毒株(master strain)”。冷适应活病毒疫苗和灭活病毒疫苗以不同方式刺激免疫系统，但这两种情况中，缺乏足够的免疫原性是流感疫苗接种的最重要的缺点之一，尤其是对于老年人。尽管ca活流感病毒疫苗被认为是足够安全的，减毒的确切遗传和分子机制并未被彻底理解。冷适应流感疫苗的安全属性据称是基于散布在内部基因区段上的大量点突变之上的。但只有少数通过作图定位到聚合酶基因内的突变可以造成那些不能在正常体温复制的冷适应病毒株的弱化(Herlocher, M. L.，A. C. Clavo, and H. F. Maassab. 1996，Virus Res. 42 :11-25 ；Herlocher,M. L.，H. F. et al.，1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90 6032-6036)。事实上，活疫苗株的遗传稳定性受到了诸多质疑，因为从接种了疫苗的宿主体内重新分离得到的病毒显示出额外的点突变，而这些点突变可能最终发挥出“抑制”突变的作用，造成回复病毒的复制性能加强并可能丧失温度敏感的表现型(HerlochenM. L.，H. F. et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90 :6032-6036, Treanor, J. , M. et al. , 1994 JVirol. 68 :7684-7688.)。对流感遗传学的新认识给构建用于活疫苗的理想免疫株提供了指导，其中可能通过靶向遗传工程将全部的主要致病因子去除。A型流感病毒含有分节段的负链RNA基因组(Lamb & Krug, 1996)。8个节段编码转录酶复合体(PB1、PB2、PA、核蛋白NP)、三个整合膜蛋白(凝血素HA、神经氨酸苷酶NA、蛋白通道M2)、基质蛋白(Ml)、核输出蛋白(NS2/NEP)和非结构性多功能致病因子NSl的亚基。已证实,显示缺失NSl蛋白，由于在干扰素感受态(interferon competent)细胞或生物体中不能复制(复制缺陷表现型)会导致流感病毒的毒力明显减弱。缺少NSl蛋白的病毒不能拮抗被感染的细胞产生的细胞因子，因此诱发自体佐剂化(self-adjuvanting)和免疫调节效应。用DelNSl病毒进行免疫后的免疫反应特征是引发与优势IgG2A同种型抗体反应相关的Thl型免疫反应(B. Ferko et al. 2002)。据报道存在由节段2的替代ORF编码的第11个蛋白(Chen et al.，2001)。这个促细胞凋亡蛋白能够与线粒体蛋白ANT3 (腺嘌呤核苷酸转运蛋白3)和VDACl (电压依赖性阴离子通道I)相互作用，被认为是重要的致病因子。在被感染的宿主免疫细胞中观察到了PB1-F2诱发的细胞类型依赖性细胞死亡，而表皮细胞中未见到这一现象。有可能病毒致病性的提高是由于被感染免疫细胞的凋亡造成了免疫反应的延迟。据估计在病毒复制的初期，PB1-F2的功能损害了诸如巨噬细胞和树突细胞的专职抗原递呈细胞递呈抗原的能力。在几个流感病毒株中缺失PB1-F2 ORF导致病毒因为更快地被从小鼠呼吸道清除而使毒力部分弱化(Zamarin D. et al.，J. Virol. 2006，7976-7983)。还不清楚 PB1-F2 蛋白是否参与先天性或获得性免疫反应的调节或者病毒生长特性的调节。Romanova等描述了对复制缺陷性减毒delNSl H5N1候选活流感疫苗的临床前评 估。疫苗制剂在三个动物模型中进行了研究，被给予小鼠、白鼬和猕猴。疫苗在经鼻内给药后，免疫动物没有显示排出(PLOS ONE, Vol 4，Article E5984)。Zell等描述了对流感A PB1-F2序列进行大量评估从而获得关于PB1-F2广泛存在的详尽信息(J. Gen. Virology, 2007,88, pp. 536-546)。W02008/043805描述了两性霉素B作为培养流感病毒的补充物。US2009/0074804公开了适合用于生产哺乳动物使用的疫苗的分离流感病毒株，所述病毒株含有至少一个经过改造的流感病毒蛋白。鉴于目前对安全有效疫苗的需求，本专利技术的目的是改善现有疫苗株的安全性和免疫原性，并开发适合给人类，特别是3岁以下幼童(即传统的不经肠的灭活疫苗可能对其无效的年龄组)预防季节性和流行性流感的新一代鼻内流感疫苗。本申请提供的实施方案实现了所述目的。专利技术概述令人惊奇的发现是包含缺少功能性NSl蛋白或者含有部分NSl蛋白缺失的DelNSl重组合病毒在小鼠中的潜在免疫原性可以通过另外的PB I-F2修饰或缺失得以加强。PB1-F2缺失可以促进IgGl (Th2型)和IgG2a(Thl型)免疫反应。这些效果显示对于构建用于鼻内接种的更有效疫苗株来说，双重修饰或缺失可能是有利的。替代地，还惊奇地发现包含经过改造的NS和PBl基因节段的流感病毒在感染后第一个24小时内，在细胞培养中表现出生长加快。因此双突变体，特别是那些缺少功能性NSl和PB1-F2蛋白的双突变体与仅仅缺失了 NSl蛋白的流感病毒株相比，似乎能够更高效地复制。因此，本专利技术提供了这样的流感病毒，所述流感病毒中NS和PBl基因节段均经过改造，并且PB1-0RF (开放读框)被在不改变PBl氨基酸序列的情况下通过引入至少一个终止密码子或者去除至少一个甲硫氨酸/起始密码子进行了改造。优选地，所述流感病毒是复制缺陷型病毒。根据特定的实施方案，复制缺陷型流感病毒包含的PBl节段被通过在PB1-F2 ORF内引入多个终止密码子和/或去除甲硫氨酸密码子进行了改造。更具体地说，改造发生在按照 SEQ ID NO. I 的编号，核苷酸位点1'120、1153、了222、了234、了255、了270 和6291 中的任意位点上。再更具体地说，PBl基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.05 EP 09175096.8;2009.07.22 US 61/227,6381.流感病毒，其中NS节段包含至少一个核苷酸的插入、取代或缺失，并且其中PB1-F2开放读框(ORF)通过引入至少一个终止密码子而被改造。2.权利要求I所述的流感病毒，其中所述病毒是复制缺陷型的。3.权利要求I或2所述的流感病毒，其中PBl节段通过引入多个终止密码子而被改造。4.权利要求1-3中任一项所述的流感病毒，其中所述改造发生在按照SEQID NO. I编号的核苷酸位点T120、T153、T222、T234、T255、T270和G291中的任何一个。5.权利要求1-4中任一项所述的流感病毒，其中PBl基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：T马斯特，E罗马诺夫斯卡亚罗曼科，O基塞莱夫，M沃尔斯切克，B弗科，A艾戈洛夫，
申请(专利权)人：阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司，
类型：发明
国别省市：