本发明专利技术涉及选择在组织培养细胞中生长的流感病毒以制备适于组织培养的病毒分离物的方法。本发明专利技术还涉及由所述分离物制备的疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2007年12月14日，申请号为200780051376. 3的、专利技术名称和本专利技术相同的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2006年12月15日申请的美国申请60/875287和2006年12月28日申请的美国申请60/882412的优先权，二者均纳入本文作为参考。
技术介绍
人们已认识流感流行和大流行达数个世纪，并且它已经导致了相当多的生命丧失。流感病毒是一种分段的含有RNA的病毒，属于正黏病毒科。流行和大流行是由具有在人群中很少有免疫性的新包膜成分的病毒引起的。这些新成分通常为人类和动物流感病毒突变和/或混合的结果。然而，流感病毒的衣壳为略微多晶的，其外表面与所有病毒一致，由脂质包膜组成，从脂质包膜上伸出两种突出的糖蛋白棘血细胞凝集素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)。有三种类型的流感病毒A、B和C型。仅A型流感病毒基于两种主要的表面糖蛋白HA和NA进一步分类为亚型。A型流感亚型根据病毒株进一步分类。B型流感病毒仅感染哺乳动物并在人中致病，但一般不如A型严重。C型流感病毒也仅仅感染哺乳动物，但仅在儿童引起非常轻的呼吸道疾病。它们在遗传学上和形态学上与A和B型不同。A型流感病毒感染很多种动物，包括哺乳动物，如，人、马、狗、猪、白鼬、鸟类，如鸭、鸡和火鸡。有16种已知HA血清型和9种已知NA血清型。鸟类为特别重要的储存库，其生成遗传学上/抗原学上不同的病毒的库，所述病毒通过人和动物之间的近距离接触转移到人群中。猪可感染人类和鸟类流感株。因为这种不寻常的特征，当同一细胞感染两种类型的病毒时，猪被认为是允许鸟类和人类病毒之间基因交换的“混合容器”。流感病毒基因组由分成8段的单链(_)有义RNA组成(C型流感为7段)。因为已经作出了大量遗传学研究(传统和分子)基因组结构是详知的。每段编码一种或两种病毒蛋白。人们相信流行和大流行是因为流感病毒HA和NA蛋白的两种不同的方式的遗传改变而引起抗原漂移和抗原转变。抗原漂移经常发生，而抗原转变仅仅偶尔发生。A型流感病毒进行两种变化，B型流感病毒仅通过更渐进性的过程抗原漂移而变化。抗原漂移是指通过两个基因中的点突变发生的小而渐进的变化，所述两个基因包含产生主要表面蛋白HA和NA的遗传物质。抗原转变是指在人中产生目前不在人群中流行的新的A型流感病毒亚型的突然而大的变化。抗原转变可通过动物(家禽)与人的直接传播发生，或通过A型人流感和A型动物流感病毒基因混合而通过被称为遗传重配的过程产生新的A型人流感病毒亚型。抗原转变产生新的A型人流感亚型。当两种不同的流感病毒感染相同细胞并平分或交换一个或多个RNA片段时发生遗传重配。例如，如果转移的片段是HA，则可导致新的病毒株出现，所述病毒株在抗原上为新型，并且进入人群时具有很少或没有免疫性。这个结果可导致流行和/或大流行。流感病毒进入细胞能通过HA棘与含有N-乙酰神经氨酸(NANA =唾液酸)端基的粘蛋白结合而变容易。结合后，颗粒通过内吞作用经包被的凹陷卷入形成内吞囊泡，最后形成核内体。这些被细胞酸化并且在约pH 5. O下，HA单体在核内体中被类胰蛋白酶裂解以激活它们内化。一旦内化，则发生病毒复制并产生流感症状。人们对最近的流感爆发相当关注。业已在狗中鉴别出因犬流感病毒(CIV)所致的一种严重呼吸道疾病。这种呼吸道疾病已被证实有高度传染性。而且，CIV可引起100%的感染率和80%的发病率，以及在严重感染中高达5-8%的死亡率。自从2004年在灵提赛犬中首次检出(Crawford等人,Science 310(5747) :482-485 (2005)), CIV已经很快蔓延至全美国，其中至少25个州报道CIV爆发，并且二十七个州报道CIV血清阳性。引起最近爆发的CIV血清型是H3N8。这种CIV血清型最初在马中发现，认为它是越过种属障碍进入犬类。可能抗犬流感病毒有效疫苗的缺乏在这种 病毒在狗中快速而广泛的传播中起重要作用。A型流感(H5N1，禽流感)病毒也称为“H5N1病毒”是一种A型流感病毒亚型，主要在鸟类中发生，在鸟类中有高度传染性，对鸟类可致死。H5N1病毒不经常感染人类，但这些病毒感染在人类中发生过。迄今为止，已在10个国家(主要在亚洲)报道了超过200例的人类确诊病例，这些病例导致了 150余人死亡。幸运的是，这种病毒还不容易从鸟类传播至人类或在人类之间互相传播。然而，这有可能发生，导致流行或大流行。防止与流行或大流行相关的发病率和致死率的最佳策略是疫苗接种。目前给予人类的流感疫苗在预防住院治疗和死亡方面有很高的性价比，然而，季节性疫苗的世界年产量有限，并且不能实际地覆盖全球高风险人群。现有疫苗是用自世界卫生组织(WHO)或疾病控制中心(⑶C)获得的病毒在蛋中制成，WHO和⑶C每年为疫苗生产提供病毒种子。流行病毒的HA变化(抗原漂移)需要在流感两次爆发期间周期性置换疫苗株。WHO发表了包括南半球和北半球所包括的半年推荐株。为允许有足够的时间生产，WHO在二月测定哪个疫苗株应包括在下个冬天的疫苗内。一般来说，成人一个剂量含有45 u g HA(15ii g每种，3种病毒)的等同物。这个剂量大约为从为一个感染的含胚鸡蛋的尿囊液中得到的纯化的病毒的量。如果制备I亿剂量的灭活的流感病毒疫苗，制造商必须获得I亿个含胚鸡蛋。这使得疫苗生产依赖于高质量含胚鸡蛋的时闸可行性和WH0/CDC提供的种子株。大部分原型种子株甚至在含胚鸡蛋中也不容易生长至高效价。要克服这个困难问题，政府机关首先要通过与高产率的实验室株A/PR/8/34经典重配(以6 2重配从A/PR/8/34株中得到6个片段)创造出高产率的实验室株。遗憾的是，这个方法可能很难做至IJ，并且可能影响所得到的疫苗的抗原性。因此，需要提供生产疫苗的替代方法以预防由流感、特别是高度致病株如H5N1引起的临床疾病。还有，仍然需要提供在快得足以有效预防可能的流行和/或大流行的时间内生产大量救生流感疫苗的方法。本专利技术解决这些和其他需求。本文所引用的任何参考不应被理解为允许这种参考作为本申请的“现有技术”。专利技术简述本专利技术涉及预防A型和B型流感感染的疫苗。相对于现有技术的疫苗和方法，本专利技术的疫苗和相关方法提供大量优点。例如，本专利技术的疫苗用组织培养细胞代替含胚鸡蛋生产。所述创造性生产方法通过省略传统疫苗生产步骤而节约了关键时间。另外，本专利技术的疫苗可用于那些对蛋物质过敏者。本专利技术还提供可在疫苗中应用的新型免疫原性组合物。这些新型免疫原性组合物可用于免疫动物，包括鸟类，以抵抗流感。在本法明的具体实施方式中，疫苗接受者为哺乳动物。在一个方面，本专利技术提供保护犬类抵抗犬流感病毒(CIV)所致的犬呼吸道疾病的疫苗。在另一方面，本专利技术提供保护人类抵抗通过遗传重配自然产生的流感病毒株的疫苗。本专利技术提供流感病毒分离物，其特别适于在组织培养细胞中生长。在一个具体实施方式中，改造的流感病毒分离物根据其在所选择的组织培养细胞系中生长的能力，用有限稀释克隆(limit dilution cloning)选择。在一个具体实施方式中，通过将包含大量流感亚群的一些流感病毒通过系列稀释为大量等分试样，来选择适于在培养细胞系中生长的流感病毒亚群。然后大量等分试样与培养的细胞系接触，本文档来自技高网...
【技术保护点】
通过有限稀释克隆选择在组织培养细胞中生长的人流感病毒的方法，所述方法包括：a.将一定量的人流感病毒系列稀释，以获得一系列人流感病毒浓度递减的稀释物，b.使每一份系列稀释的人流感病毒与组织培养细胞接触；c.使在步骤b中进行了接触的所述人流感病毒生长足以产生致细胞病变效应(CPE)的一段时间；d.从接触了来自引起CPE的、系列稀释物中的最高倍稀释物的人流感病毒的组织培养细胞中收获步骤c中生长的人流感病毒；以及e.用在步骤d中收获的一定量的人流感病毒重复所述a到d的步骤。
【技术特征摘要】
2006.12.15 US 60/875,287;2006.12.28 US 60/882,4121.通过有限稀释克隆选择在组织培养细胞中生长的人流感病毒的方法，所述方法包括 a.将一定量的人流感病毒系列稀释，以获得一系列人流感病毒浓度递减的稀释物， b.使每一份系列稀释的人流感病毒与组织培养细胞接触； c.使在步骤b中进行了接触的所述人流感病毒生长足以产生致细胞病变效应(CPE)的一段时间； d.从接触了来自引起CPE的、系列稀释物中的最高倍稀释物的人流感病毒的组织培养细胞中收获步骤c中生长的人流感病毒；以及 e.用在步骤d中收获的一定量的人流感病毒重复所述a到d的步骤。2.根据权利要求I的方法，还包括在的步骤b的接触之前将所述一定量的人流感病毒与有效量的胰蛋白酶混合。3.根据权利要求2的方法，其中所述胰蛋白酶为IX型胰蛋白酶。4.根据权利要求2的方法，其中所述步骤b的接触是在少于O.Ol的MOI下进行的。5.根据权利要求I的方法，其中所述组织培养细胞为哺乳动物胚胎肾细胞。6.根据权利要求5的方法，其中所述哺乳动物胚胎肾细胞为人胚胎肾细胞。7.根据权利要求I的方法，其中所述的人流感病毒为A、B或C型流感病毒。8.根据权利要求7的方法，其中所述人A型流感病毒为H5N1株。9.根据权利要求I的方法，其中所述人流感病毒分离物最初在含胚鸡蛋中生长，以得到大量的人流感病毒。10.根据权利要求I的方法，其中所述人流感病毒分离物最初在羊膜上生长，以得到大量的人流感病毒。11.生产人流感病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：T·L·沃斯梅恩，P·高，B·A·埃迪，O·Y·阿布德尔梅吉，
申请(专利权)人：先灵普劳有限公司，
类型：发明
国别省市：
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