用于病毒拯救的改良反向遗传方法技术

提供通过反向遗传拯救病毒的方法，其中细胞在转染后添加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及反向遗传领域。此外，其涉及制造用于保护抵御各种病毒的疫苗。
技术介绍
反向遗传可在细胞培养中重组表达和操作RNA病毒。它是病毒学和疫苗制造的有效工具，因为能快速生产重组病毒(包括重配株)和/或其突变型。所述方法涉及用一种或多种编码所述病毒基因组的表达构建体转染宿主细胞和从所述细胞中分离所述病毒。 通过反向遗传进行病毒拯救的一个缺点是过程低效且通常导致病毒产量不令人满意。因此本领域仍需要提供更有效的反向遗传替代方法。优选实施方式概述本专利技术人意外发现反向遗传的低效可通过用反向遗传构建体转染细胞然后向该转染细胞中添加更多细胞而得到显著改良。本专利技术人猜测观察到的效率增加是由于转染对所述细胞有害。因此，任何拯救的病毒需要在带病的细胞中扩增或等待将该病毒转染到健康细胞中。这导致有活力的病毒的损失。将细胞添加到所述转染宿主细胞中能使拯救的病毒在健康细胞底物中扩增，这能显著提高病毒产量。在一个实施方式中，本专利技术提供制备病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体转染宿主细胞培养物；(ii)向(i)的转染宿主细胞中添加细胞以提供细胞混合物；和(iii)培养该细胞混合物产生病毒。在另一实施方式中，本专利技术提供制备用于生产疫苗的病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体转染宿主细胞培养物；(ii)向(i)的转染宿主细胞中添加细胞以提供细胞混合物；(iii)培养该细胞混合物产生病毒；(iv)纯化步骤(iii)中获得的病毒和任选地(V)用该病毒配制成疫苗。反向遗传反向遗传可用于生产各种RNA病毒,包括正链RNA病毒,负链RNA病毒和双链RNA病毒。因此，本专利技术提供生产重组病毒的方法，其中所述病毒用本专利技术的反向遗传方法获得。已知反向遗传系统包括用POl I启动子、细菌RNA聚合酶启动子、噬菌体聚合酶启动子等表达编码所需病毒RNA (vRNA)分子的DNA分子。此外，病毒需要特定蛋白以形成感染病毒时，系统还提供这些蛋白，例如所述系统还包括编码病毒蛋白的DNA分子从而两种DNA的表达导致完整感染病毒的组装。反向遗传用于vRNA表达时，本领域技术人员清楚所述序列元件彼此的精确间隔对于所述聚合酶启动复制至关重要。因此编码所述病毒RNA的DNA分子正确位于所述polI启动子和所述终止序列之间很重要，但该定位在反向遗传系统操作人员的能力范围内。通常，反向遗传适合于表达需要在生命周期中生产基因组RNA的任何病毒。此类病毒包括但不限于正链和负链RNA病毒，如下文所述病毒。所述病毒优选正粘病毒如流感病毒。本专利技术的方法还适合非节段以及分节段病毒。所述病毒为正链RNA病毒时，用含所述病毒基因的表达构建体转染细胞通常已足够。例如，含有脊髓灰质炎病毒基因组的质粒转染引起传染性脊髓灰质炎病毒的回收。负链RNA病毒的反向遗传更具挑战性，因为所述反义病毒RNA通常无感染性且需要RNA聚合酶来完成生命周期。因此，必须以蛋白或用于原位蛋白表达的基因形式提供所述病毒聚合酶。所述病毒的传染性需要蛋白质时，通常优选使用双向表达构建体，因为这能减少所述宿主细胞需要的表达构建体总数。因此,本专利技术方法可利用至少一种双向表达构建体，其中基因或cDNA位于上游pol II启动子和下游非内源poll启动子之间。从所述pol II启动子转录所述基因或cDNA产生可翻译为蛋白质的加帽正义病毒mRNA，而从所述非内源 pol I启动子转录产生负义vRNA。所述双向表达构建体可为双向表达载体。为了生产重组病毒，细胞必须表达组装病毒粒子所需病毒基因组的所有节段，克隆到本专利技术表达构建体内的DNA优选提供所述病毒所有RNA和蛋白，但也可使用辅助病毒以提供一些RNA和蛋白，尽管优选不使用辅助病毒的系统。所述病毒为非节段病毒时，通常可通过在本专利技术方法中利用单一表达构建体实现该系统，但使用多于一种表达构建体表达非节段病毒的病毒基因组也在本专利技术的范围之内。所述病毒为分节段病毒时，本专利技术方法通常用多于一种表达构建体表达所述病毒基因组。然而，还考虑在单一表达构建体上组合所述病毒基因组的一种或多种节段或甚至所有节段。本专利技术方法尤其适于生产重配病毒株。所述技术可用质粒的体外操控以产生病毒节段的组合、以便于操控病毒节段中的编码序列或非编码序列、以引入突变等。优选使用所述表达系统生产重配病毒株，因为这样可显著减少获得重配种病毒所需的时间，这在需要快速生产疫苗以抵抗流行病的情况中尤其有用。因此本专利技术本方面的方法优选使用表达来自或源自至少两种不同野生型毒株的病毒基因的一种或多种表达构建体。还可使用导致所述宿主细胞内表达辅助蛋白的表达构建体。例如，可能宜表达非病毒丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)，作为反向遗传系统的一部分。表达构建体本专利技术所用的编码病毒RNA分子的表达构建体可为本领域通常用于拯救病毒的任何表达构建体。所用的表达构建体可为单向或双向表达构建体。宿主细胞表达多于一种转基因时(不论在相同或不同表达构建体上)可能使用单向和/或双向表达。双向表达构建体含从同一构建体中的不同方向(即5'到3'和3'到5')驱动表达的至少两种启动子。所述两种启动子可操作性连接同一双链DNA的不同链。优选所述启动子之一是pol I启动子且至少一种其他启动子为pol II启动子。这是有利的，因为所述pol I启动子可用于表达非加帽的cRNA而所述pol II启动子可用于转录随后翻译为蛋白质的mRNA，因此同一构建体能同时表达RNA和蛋白质。所述表达构建体(不论是单向或双向)通常包括RNA转录终止序列。所述终止序列可为内源终止序列或对所述宿主细胞非内源的终止序列。本领域技术人员清楚合适的终止序列且其包括但不限于RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、和核酶。此外，所述表达构建体可包括针对mRNA的一种或多种聚腺苷酸化信号，尤其在表达受pol II启动子控制的基因的末端。用在所述表达构建体中的pol I和pol II启动子可源自与表达该表达构建体的宿主细胞相同分类学目的生物体。或者，该启动子可源自与所述宿主细胞不同分类学目的生物体。术语“目”指常规分类学分级，目的示例为灵长目、哨齿目、食肉目、有袋目、鲸目等。人和黑猩猩在同一分类学目中(灵长目)，但人和狗在不同的目中(灵长目与食肉目)。本专利技术的方法中，可用至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种或至少12种表达构建体转染宿主细胞。表达构建体可为载体，如质粒或其他游离构建体。此类载体通常包括至少一个细菌和/或真核的复制起点。此外，所述载体可包括可在原核和/或真核细胞中筛选的选择性标记。此类选择性标记的示例为对抗生素产生抗性的基因，如氨苄青霉素或卡那霉素。所述载体还可包括一个或多个多克隆位点以方便DNA序列克隆。 或者，表达构建体可为线性表达构建体。该线性表达构建体通常不含任何氨苄青霉素和/或选择序列。但是，包含该氨苄青霉素和/或选自序列的线性构建体也在本专利技术的范围内。使用该线性表达构建体以表达流感病毒的方法在参考文献6中描述。本专利技术的表达构建体可用本领域已知方法产生。例如,参考文献7中描述了此类方法。所述表达构建体为线性表达构建体时，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·道米策，B·艾纳，P·苏帕菲帕特，M·弗兰蒂，P·马森，J·乌伦多夫，M·马特洛索维基，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：