本发明专利技术提供制备重配病毒的方法，其中血凝素和神经氨酸酶基因的转录和/或翻译被抑制。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于流感病毒重配领域。另外，其涉及抗流感病毒感染的疫苗制造。
技术介绍
抗流感感染的最有效的保护是接种抗流行毒株的疫苗，而且重要的是要尽快生产用于制造疫苗的流感病毒。野生型流感病毒在蛋和细胞培养物中通常生长缓慢。为了获得用于疫苗生产的较快生长的毒株，目前常用的实践是用较快生长的高产率骨架株与流行的流感毒株(本文 中称为疫苗株)重配。可如下实现重配用疫苗株和骨架株在细胞培养物或胚胎蛋的羊膜水中共同感染细胞。然后加入骨架株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白特异性抗体来阻滞携带骨架株的(HA)和(NA)蛋白的流感病毒复制。该处理经数次传代可选到快速生长的重配流感病毒，所述病毒包含来自疫苗株的HA和NA区段和来自骨架株的其它病毒区段(即那些编码 PBl、PB2、PA、NP、Ml、M2、NSl 和 NS2 的区段)。目前的方法有若干缺点。例如，从得到一种新流感毒株至获得最终高速生长重配株通常需要约35天，这导致流感病毒生产的延迟。另外，需要将病毒传代数次，增加了 HA抗原中发生突变的风险，这导致不需要的抗原性改变。用多克隆抗血清抑制非重配病毒增殖还会增加引入外来病毒因子和其它污染物的风险。本专利技术的目的是提供生产重配流感病毒的进一步并改进的方法。优选实施方式概述专利技术人目前已意外地发现，在病毒生产中优先降低骨架株的HA和/或NA基因转录和/或翻译(例如通过采用RNA抑制)可大幅度提高重配病毒的产生速度。所述方法还具有不依赖使用抗体并因此避免使用动物衍生产品的优点。另外，由于为获得重配病毒所需的传代次数减少，自发性突变的可能性降低。本专利技术提供一种制备重配流感病毒的方法，所述方法包括步骤(i )用第一流感毒株和第二流感毒株感染培养宿主；(ii )用抑制剂接触步骤(i )的培养宿主，其中所述抑制剂优先降低(i)中流感毒株中一种的血凝素和/或神经氨酸酶基因的转录和/或翻译；(iii)培养所述培养宿主以产生重配病毒，并任选地(iv )纯化步骤(iii)中获得的病毒。本专利技术所述的方法还可包括以下步骤(V )用步骤(iii )或步骤(iv )中获得的重配病毒感染培养宿主；(vi)培养来自(V )中的宿主来产生更多的病毒；并且任选地(vii)纯化步骤(vi )中获得的病毒。本专利技术提供一种制备重配流感病毒的方法，所述方法包括步骤(i )用具有至少一个靶区段的第一流感病毒株感染培养宿主；(ii )将编码来自第二流感病毒株的靶区段的一个或多个表达构建体引入所述培养宿主；(iii)用抑制剂接触所述培养宿主，其中所述抑制剂优先降低第一流感毒株的靶区段的转录和/或翻译；(iv )培养所述培养宿主以产生重配病毒；并且任选地(V )纯化步骤(iv )中获得的病毒。本专利技术提供一种包含编码以下区段的表达构建体的细胞(i )第一甲型或乙型流感病毒基因组的所有八个病毒区段；(ii )第二甲型或乙型流感病毒基因组的至少一个靶区段，其中第二流感毒株的靶区段序列不同于第一流感毒株的靶区段；和(iii)抑制剂，其中所述抑制剂优先降低第一流感毒株的靶区段的转录和/或翻译。本专利技术还提供了一种制备重配流感病毒的方法，所述方法包括培养该细胞以产生重配病毒的步骤。所述方法还可包括以下步骤用从所述细胞获得的重配病毒感染培养宿主，然后培养所述宿主来产生更多的病毒，继而(任选地)纯化用该途径获得的更多的病毒。 本专利技术还提供一种生产流感病毒的方法，所述方法包括以下步骤(a)用以本专利技术所述方法获得的重配病毒感染培养宿主；(b)培养来自步骤(a)的宿主以产生病毒；并任选地(C)纯化步骤(b)中获得的病毒。本专利技术还提供了一种制备疫苗的方法，所述方法包括步骤(d)通过上述任一个实施方式的方法制备病毒，和(e)用该病毒制备疫苗。流感毒株流感病毒为分区段的负链RNA病毒。甲型和乙型流感病毒具有八个区段(PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M和NS)，而丙型流感病毒则具有七个区段(不含NA区段)。所述病毒至少需要四种病毒蛋白(PB1、PB2、PA和核蛋白)的存在才能启动基因组复制。本专利技术所述方法采用流感骨架株和疫苗株。所采用的骨架株和疫苗株通常具有一个或多个(例如2、3、4、5、6、7或8个)病毒区段的不同，其可被下文所述的抑制剂差异性抑制。骨架株的所需区段相比疫苗株被更多地抑制，由此有利于重配株的生产。疫苗株可以是大流行性和大流行间期性(季节性)流感毒株。所述疫苗株可包含甲型流感病毒 HA 亚型 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或H16。它们可包含甲型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。所述疫苗株为季节性流感毒株时，疫苗株可具有Hl或H3亚型。本专利技术一方面中的所述疫苗株为HlNl或H3N2 株。所述疫苗株也可以是大流行性毒株或潜在的大流行性毒株。可能会引起大流行爆发的流感毒株特征是(a)相比目前流行的人毒株中的血凝素，其含有新血凝素，即十年来未在人群中被证实过的血凝素(如H2)，或之前在人群中完全不曾发现的血凝素(如H5、H6或H9，通常只在鸟群中发现)，以至人群对该毒株的血凝素没有免疫力；(b)其能在人群中平行传播；并且(C)其对人有致病性。当所述重配病毒用于产生对大流行性流感(例如H5N1株)免疫的疫苗时，优选含有H5血凝素型的疫苗株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行性毒株。本专利技术尤其适用于制备用于预防潜在大流行性毒株疫苗中的重配病毒，所述潜在的大流行性毒株能够或已经从非人类的动物群传播到人类，例如猪一源HlNl流感毒株。所述骨架株可以是任何已知流感病毒株，但优选在细胞和/或蛋的尿囊液中快速生长的流感病毒株。该优选的原因是制备重配流感病毒通常是为获得用于疫苗生产的快速生长流感病毒。此类骨架株的示例包括但不限于A/Puerto Rico/8/34、A/Ann Arbor/6/60和 B/Ann Arbor/1/66。根据本专利技术制备的重配甲型流感病毒可包括来自A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(通常6个区段来自A/PR/8/34，HA和NA区段来自疫苗株，即6:2重配)。也可包括来自A/WSN/33病毒或来自在产生用于疫苗制剂的重配病毒中有用的任何其它病毒株的一个或多个RNA区段。重配甲型流感病毒可包括来自AA/6/60流感病毒(A/Ann Arbor/6/60)的少于6个(即1、2、3、4或5个)病毒区段。重配乙型流感病毒可包括来自AA/1/66流感病毒(B/Ann Arbor/1/66)的少于6个(即1、2、3、4或5个)病毒区段。 本专利技术所述的重配流感病毒株可包括来自A/California/4/09株的一个或多个基因组区段，优选HA区段和/或NA区段(由于这些区段为主要疫苗抗原)。因此，例如，HA基因区段可编码相比SEQ ID N0:8而言，与SEQ ID NO:7更密切相关的Hl血凝素(即使用相同算法和参数，其相比SEQ ID N0:8而言，与SEQ ID NO:7有更高程度的序列相同性)。SEQ ID N0:7和8的相同性为80%。相似地，NA基因可编码相比SEQ I本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：H·特鲁赛姆，P·马森，M·弗兰蒂，B·基纳，M·赛克卡，J·恒茨克，D·莫里西，F·JC·拿塔，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：
国别省市：
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