新的流感病毒免疫表位制造技术

提供了在植物或其部分中合成流感病毒样颗粒（ＶＬＰ）的方法。该方法包括在植物中表达新流感ＨＡ蛋白及其纯化。本发明专利技术还涉及包含流感ＨＡ蛋白和植物脂质的ＶＬＰ。本发明专利技术还涉及编码经改进之流感ＨＡ的核酸以及载体。该ＶＬＰ可用于配制流感疫苗，或者可用于丰富现有疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的流感病毒免疫表位
本专利技术涉及病毒样颗粒的生产。更具体而言，本专利技术涉及包含流感抗原(更特别地，与其他流感毒株具有广泛交叉反应性的经修饰流感抗原)之病毒样颗粒的生产。
技术介绍
流感是由呼吸系统病毒引起的人类死亡首要原因。常见的症状包括发热、咽喉疼痛、气短和肌肉酸痛等。在流感季节，流感病毒感染全世界10～20％的人口，每年导致250～500,000人死亡。流感病毒是从受感染之哺乳动物细胞的质膜出芽的包膜病毒。根据所存在的核蛋白和基质蛋白抗原，流感病毒分为A型、B型或C型。根据所存在的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的组合，A型流感病毒可进一步分成若干亚型。HA控制病毒与宿主细胞结合以及穿入宿主细胞的能力。NA从宿主细胞和病毒表面蛋白上的聚糖链除去末端唾液酸残基，这防止病毒凝集并有利于病毒运动。目前，已鉴定出16种HA(H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型。每种A型流感病毒具有一种HA糖蛋白类型和一种NA糖蛋白类型。一般而言，每种亚型均表现出物种特异性；例如，已知所有HA和NA亚型均感染鸟类，而只有H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10、N1、N2、N3和N7显示感染人类(Horimoto2006；Suzuki2005)。含有H5、H7和H9的流感病毒被认为是致病性最强的A型流感病毒形式，并且最有可能引起将来的大流行。流感大流行通常由高传播性且高致病性的流感病毒引起，并可导致全球性疾病和死亡升级。在20世纪，新的A型流感亚型的出现导致四次主要的大流行。1918～1919年由H1N1病毒引起的西班牙流感在1917年至1920年间导致世界范围内超过五千万人死亡。当前，新亚型出现的风险或者动物中特有的亚型向人传播的风险总是存在。特别受到关注的是高致病性形式的禽流感(也称作“鸟流感”)，据报道其已经在全世界若干国家爆发。在许多情形下，该禽流感可在48小时内导致接近100％的死亡率。据推测，1997年在香港首次鉴定的禽流感病毒(H5N1)向其它亚洲国家和欧洲的传播与野生鸟类的迁徙模式有关。目前对抗人中流感的方法是每年接种疫苗。疫苗通常是预测为即将到来之“流感季节”强势毒株(dominantstrain)的几种毒株的组合。所述预测由世界卫生组织来协调完成。一般而言，每年生产的疫苗剂量数不足以接种全世界的人群。例如，加拿大和美国获得足以免疫其约三分之一人口的疫苗剂量，而欧盟仅有17％的人口可接种疫苗。很显然，在世界范围的流感大流行到来时，目前全世界的流感疫苗生产不能满足需求。即使所需的年产量在给定年份中可以某种方式实现，然而强势毒株每年都在变化，因此在一年的低需求时间大量储备是不切实际的。经济地、大规模地生产有效流感疫苗是政府和私营企业等非常关心的。目前，用于疫苗中的最重要来源病毒储液是在受精的蛋中生产的。收获病毒颗粒，为了得到灭活病毒疫苗，通过去污剂破坏使其灭活。减毒活疫苗由适于在低温下生长的流感病毒制备，这意味着在正常体温下所述疫苗的毒力减弱。这样的疫苗在美国被批准用于5～49岁的个体。全病毒灭活疫苗是通过化学试剂灭活而变为无害的，并且其已在胚蛋或哺乳动物细胞培养物中生产。所有这些类型的疫苗都显示出一些特定的优点和缺点。全病毒来源之疫苗的一个优点是这种疫苗所引起的免疫类型。通常，裂解型疫苗诱导强的抗体应答，而由全病毒制得的疫苗诱导抗体(体液)应答和细胞应答。尽管功能性抗体应答是与疫苗诱导之保护作用相关的获批标准，然而越来越多的证据表明T细胞应答对流感免疫也很重要，其还可为老年人提供更好的保护。为了诱导细胞免疫应答，开发了由全病毒制得的疫苗。由于流感毒株(例如H5N1)的高致病性，因此在BL3+设备中生产这些疫苗。对于高致病性流感毒株(例如H5N1)来说，为了降低流感毒株的致病性、使其无毒且更容易在胚蛋或哺乳动物细胞培养物中生产，一些制造商对血凝素的基因序列进行了修饰。另一些人还使用重排列(reassortant)流感毒株，其中血凝素和神经氨酸酶蛋白的基因序列被克隆进高产量、低致病性的流感供体株(A/PR/8/34；QuanF-S等，2007)中。尽管这些方法可生产有用的疫苗，但是它们仍不能提供以满足正常年份全球需求的所需规模来大量、低成本及快速生产疫苗的解决方法，并且当大流行到来时几乎必然地不能满足需求。利用该反向遗传技术，还可能需要对HA蛋白的基因序列进行突变以使其无毒。就高致病性流感株而言，全病毒疫苗的生产需要防护(confinement)程序或者所得疫苗不与流行中病毒的基因序列完全匹配。在减毒活疫苗的情形中，仍存在所施用的疫苗可与来自宿主的流感病毒重组而产生新流感病毒的风险。尽管该方法保持了抗原表位和翻译后修饰，但是存在许多缺点，包括由于使用全病毒而引起的污染风险以及取决于病毒株的不确定的产量。亚最佳水平的保护可由以下原因导致：由于将病毒引入蛋中而引起的病毒遗传异质性。其它缺点包括为了获得蛋而进行大量计划，由于在纯化中使用的化学品引起的污染风险以及生产时间长。此外，对蛋中蛋白质过敏的人可能不适于接种所述疫苗。在大流行的情形中，需要使毒株适于在蛋中生长以及所得产量不确定减缓了裂解型疫苗的生产。尽管此技术用于生产季节性疫苗已使用了多年，但是因为世界范围的生产能力有限，因此它很难在合理的时间范围内响应于大流行。流感病毒A型H1N1最近在墨西哥的爆发也显示出对开发新出现毒株之疫苗的快速生产方法的迫切需要。为了避免使用蛋，已经在哺乳动物细胞培养物中(例如在MDCK或PERC.6细胞等中)生产流感病毒。另一种方法是反向遗传方法，其中通过用病毒基因转化细胞来生产病毒。然而，这些方法也需要使用全病毒以及复杂的方法和特定的培养环境。已开发了几种作为候选重组流感疫苗的重组产物。这些方法关注A型流感病毒HA和NA蛋白的表达、制备以及纯化，包括利用杆状病毒感染的昆虫细胞(Crawford等，1999；Johansson，1999)、病毒载体和DNA疫苗构建体(Olsen等，1997)来表达这些蛋白质。流感病毒感染的特异性是公知的。简言之，感染周期是从病毒体表面HA蛋白与含有唾液酸的细胞受体(糖蛋白和糖脂)结合开始的。NA蛋白介导对唾液酸受体的处理，病毒穿入细胞则取决于HA依赖性受体介导的内吞作用。在含有流感病毒体的内化内涵体的酸性界限内，HA蛋白发生构象变化，这导致病毒与细胞膜融合，病毒脱壳以及M2介导的从核衣壳相关核糖核蛋白(RNP)释放M1蛋白，M1蛋白迁移到细胞核内用于病毒RNA合成。抗HA蛋白的抗体通过中和病毒感染性来预防病毒感染，而抗NA蛋白的抗体介导其对病毒复制早期步骤的作用。Crawford等(1999)公开了流感病毒HA在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达。所表达的蛋白质被描述为能够预防由禽类H5和H7流感亚型引起的致命性流感疾病。Johansson等(1999)教导了杆状病毒表达的流感病毒HA和NA蛋白在动物中诱导了优于常规疫苗所诱导之应答的免疫应答。杆状病毒表达的马流感病毒血凝素的免疫原性和效力可与同源DNA候选疫苗相比较(Olsen等，1997)。总之，这些数据表明，使用多种实验方法以及在不同动物模型中，可利用重组HA或NA蛋白诱导针对流感病毒攻击的高度保护。由于先前的研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．具有ＨＡ１结构域的流感病毒血凝素（ＨＡ）分子，其中所述ＨＡ１结构域完全或部分不含Ｎ－连接糖基化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/081,8112008年7月18日1.包含编码H5流感病毒血凝素(HA)之氨基酸序列的核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQIDNO.17具有90％至100％同一性，所述流感病毒血凝素包含HA1结构域，其中天然HA1结构域在154、165和286位包含N-连接糖基化位点，其中154、165和286位是N并且是糖基化序列模式N-X-T/S的一部分，并且其中通过修饰154、165或286位以编码非天冬酰胺，或者通过修饰156、167或288位以编码非丝氨酸或非苏氨酸，所述HA1结构域被修饰为在154位和/或156位不含糖基化序列模式并且在165位和/或167位不含糖基化序列模式并且在286位和/或288位不含糖基化序列模式，并且其中所述核苷酸序列与在植物中有活性的调节区域有效连接。2.根据权利要求1的核酸，其中所述核苷酸序列与SEQIDNO.29具有90％至100％同一性，由此编码154、165和286位氨基酸的残基与SEQIDNO.29相同。3.根据权利要求1的核酸，其中154、165或286位氨基酸选自Leu、Ile、Val、Thr、Ser和Ala。4.根据权利要求1的核酸，其中156、167或288位氨基酸选自Ala、Val、Ile和Leu。5.根据权利要求1的核酸，其中所述调节区域选自质体蓝素调节区；napin启动子、cruciferin启动子，或获得自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶、叶绿素a/b结合蛋白、来自马铃薯ST-LS1基因启动子的调节区，多面体启动子和gp64启动子。6.根据权利要求5的核酸，其中所述质体蓝素调节区来自苜蓿(Medicagosativa)。7.根据权利要求1至4中任一项的核酸，其中每个编码154、165和286位氨基酸的残基被修饰为编码非天冬酰胺。8.根据权利要求1的核酸，其中每个编码154、165和286位氨基酸的残基被修饰为编码丙氨酸。9.根据权利要求1的核酸，其中每个编码156、167和288位氨基酸的残基被修饰为编码丙氨酸。10.根据权利要求1的核酸，其中所述核酸如SEQIDNO.29所定义。11.在植物、其部分或植物细胞中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，所述方法包括：a)向所述植物、其部分或所述植物细胞中引入权利要求1至10中任一项所述的核酸，以及b)在允许所述核酸表达的条件下孵育所述植物、其部分或所述植物细胞，从而生产所述VLP。12.根据权利要求11的方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述核酸在所述植物、其部分或所述植物细胞中瞬时表达或者在所述植物、其部分或所述植物细胞中稳定表达。13.根据权利要求12的方法，其中所述植物、其部分或所述植物细胞来自烟草本塞姆氏(N.benthiamina)。14.根据权利要求12的方法，其还包括步骤c)：收获所述植物、其部分或所述植物细胞并纯化所述VLP。15.病毒样颗粒(VLP)，其通过权利要求11至14中任一项的方法生产。16.病毒样颗粒(VLP)，其包含权利要求1至10中任一项所限定的核苷酸序列编码的流感病毒血凝素(HA)分子。17.根据权利要求15或16的病毒样颗粒(VLP)，其包含带有植物特异性N-聚糖或经修饰N-聚糖的流感病毒HA。18.根据权利要求15的VLP，其中所述流感病毒血凝素是A型或B型的。19.根据权利要求16的VLP，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马农·科图雷，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，
类型：发明
国别省市：CA