包含来自植物包膜病毒的基质蛋白的病毒样颗粒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及包含来源于第一植物包膜病毒的基质蛋白和表面多肽的新型病毒样颗粒(VLP)。所述表面多肽包含(a)来源于靶多肽的暴露于表面的部分、来源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白(例如，糖蛋白)的(b)跨膜结构域和(c)胞质尾。所述靶多肽可以是抗原性的或治疗性的。所述第一和第二植物包膜病毒可以相同。两种植物包膜病毒中任一种都可以是植物弹状病毒。还提供了制备和使用VLP的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含来自植物包膜病毒的基质蛋白的病毒样颗粒及其用途相关申请的交叉参考本申请要求2012年3月22日提交的美国临时申请No.61/614,141的利益，为了所有目的将所述临时申请的内容通过引用整体并入本文。专利
本专利技术总地来说涉及优选在植物中产生的包膜病毒样颗粒(virus-likeparticle,VLP)以及用于产生和使用该VLP的方法。专利技术背景病毒样颗粒(VLP)是通过自组装病毒蛋白形成的无病毒基因组存在的复合结构。VLP平台日益用于增强靶特异性免疫原性。可在几个表达系统，包括植物中产生VLP。在植物中产生VLP提供了额外有利方面，包括安全性和时间效率。然而，在植物中形成VLP是生理过程的部分并且导致不同尺寸和形状的颗粒形成，这使得商业生产和平滑调控路径极具挑战性。野生型流感病毒颗粒的尺寸取决于株系，并且在70与270nm之间变化(Nayak等人,2009,VirusRes143(2):147-161)。植物产生的流感病毒颗粒(VLP)具有不同形状和宽广的尺寸范围。例如，已报导包膜多形性流感VLP尺寸为100至150nm。(Vezina等人,2011,BioPharmInternationalSupplements24(5):s27-s30)。因此，仍然存在对适合疫苗开发的更均一的VLP的需要。专利技术概述本专利技术的公开的主题涉及具有来源于包膜病毒的基质蛋白和表面多肽的新型病毒样颗粒(VLP)及其用途。这些VLP是包膜的，并且尺寸大体均一。根据本专利技术的一个方面，提供了病毒样颗粒(VLP)。VLP包含来源于第一植物包膜病毒的基质蛋白和表面多肽。表面多肽包含来源于靶多肽的暴露于表面的部分、跨膜结构域和胞质尾。胞质尾来源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白(例如糖蛋白)。VLP可在植物细胞、植物或植物的部分中产生。所述第一和第二植物包膜病毒可相同或不同，优选相同。其中任一植物包膜病毒可以是植物弹状病毒或非弹状病毒。优选地，第一植物包膜病毒是植物弹状病毒。植物弹状病毒可选自莴苣坏死黄化病毒(LettuceNecroticYellowsvirus,LNYV)、北方谷物花叶病毒(NorthernCerealMosaicvirus,NCMV)、苦苣菜病毒(SonhusVirus,SonV)和花椰菜坏死性黄化病毒(Broccolinecroticyellowsvirus,BNYV)。优选植物弹状病毒是莴苣坏死黄化病毒(LNYV)。表面多肽的暴露于表达的部分可以是抗原性多肽，例如疫苗组分，或可以是治疗剂。治疗剂可以是治疗性多肽。靶多肽可来源于病原体。病原体可选自病毒、细菌、寄生虫和真菌。病毒可以是动物病毒。动物病毒可选自流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、黄热病毒、轮状病毒和水疱性口炎病毒(VSV)。靶多肽可以是天然表面多肽。天然表面多肽可以是流感病毒的血凝素。靶多肽可以是人工表面多肽。人工表面多肽可以是来自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的保护性抗原83(PA83)、来自恶性疟原虫的Pfs25或其它可溶性蛋白或肽。流感病毒可选自甲型流感病毒和乙型流感病毒。流感病毒可选自甲型流感病毒印度尼西亚05/05株、甲型流感病毒加利福尼亚/04/2009(H1N1)株、甲型流感病毒/维多利亚/3/75(H3N2)株和乙型流感病毒香港/330/2001。靶多肽可以是治疗剂。治疗剂可以是治疗性多肽。跨膜结构域对于所述表面多肽的暴露于表面的部分可以是天然的或外来的。跨膜结构域可来源于细胞或病毒跨膜蛋白。病毒跨膜结构域可来源于胞质尾所源自的跨膜蛋白。根据本专利技术的另一个方面，提供了在植物细胞、植物或植物的部分中产生病毒样颗粒(VLP)的方法。该方法包括将一个或多个核酸分子引入植物细胞、植物或植物的部分。所述一个或多个核酸分子包含编码来源于第一植物包膜病毒的基质蛋白的第一核苷酸序列和编码表面多肽的第二核苷酸序列。表面多肽包含来源于靶多肽的暴露于表面的部分、跨膜结构域和胞质尾。胞质尾来源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白(例如，糖蛋白)。第一和第二植物包膜病毒可以相同或不同，优选相同。两种病毒中任一种都可以是植物弹状病毒或非弹状病毒。优选，第一植物包膜病毒是植物弹状病毒。该方法还包括在允许共表达基质蛋白和表面多肽的条件下维持植物细胞、植物或植物的部分，以便产生VLP。VLP在尺寸上可以是大体上均一的。该方法还可包括从植物细胞、植物或植物的部分纯化VLP。可通过渗入、微粒轰击或接种将所述一种或多种核酸分子引入植物细胞、植物或植物的部分。可将一种或多种核酸分子瞬时或稳定地引入植物或其部分。提供各种免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含有效量的本专利技术的VLP，所述VLP在尺寸上是大体上均一的。在其它实施方案中，免疫原性组合物包含有效量的通过本专利技术的方法产生的VLP，所述VLP在尺寸上是大体上均一的。免疫原性组合物还可包含佐剂和/或赋形剂。提供了在受试者中诱发针对靶多肽的免疫反应的方法。所述方法包括给受试者施用有效量的本专利技术的免疫原性组合物，其中VLP在尺寸上是大体上均一的。还提供了在受试者中诱发针对病原体的保护性免疫反应的方法。该方法包括给受试者施用有效量的本专利技术的免疫原性组合物，其中VLP在尺寸上是大体上均一的。所述靶多肽来源于病原体。病原体可以是流感病毒。靶多肽可来源于血凝素。还提供了包含一种或多种核酸分子的重组植物细胞。所述一种或多种核酸分子包含编码来源于第一植物包膜病毒的基质蛋白的第一核苷酸序列和编码表面多肽的第二核苷酸序列。所述表面多肽包含(a)来源于靶多肽的暴露于表面的部分，(b)跨膜结构域，和(c)来源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白(例如糖蛋白)的胞质尾。第一和第二植物包膜病毒可以相同或不同，优选相同。两种病毒中任一种都可以是植物弹状病毒或非弹状病毒。优选，第一植物包膜病毒是植物弹状病毒。还提供了包含本专利技术的植物细胞的植物或其部分。附图概述图1显示植物弹状病毒的(A)电子显微镜图像和(B)组织。图2是举例说明用于两种靶蛋白即靶1和靶2(各自有效地连接于调控区)的共表达的miniBYV载体的T-DNA区域的基因组组织的图示。L-Pro，木瓜蛋白酶样前导蛋白酶；Met、Hel和Pol，分别为甲基转移酶、RNA解旋酶、复制酶的RNA依赖性RNA聚合酶结构域；2Enx35S，来自花椰菜花叶病毒的具有双重增强子的35S启动子；NOS-胭脂碱合酶终止子；LB和RB，分别为T-DNA的左和右边界。图3是举例说明分别用于莴苣坏死黄化病毒(LNYV)(MLNYV)或北方谷物花叶病毒(NCMV)(MNCMV)的HAi-TM蛋白和基质蛋白的共表达的miniBYV-HAi-TM/MLNYV或miniBYV-HAi-TM/MNCMV载体的T-DNA区域的基因组组织的图示。L-Pro，木瓜蛋白酶样前导蛋白酶；Met、Hel和Pol，分别为甲基转移酶、RNA解旋酶、复制酶的RNA依赖性RNA聚合酶结构域；2Enx35S，来自花椰菜花叶病毒的具有双重增强子的35S启动子NOS-胭脂碱合酶终止子；LB和RB，分别为T-DNA的左本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含来源于第一植物包膜病毒的基质蛋白和表面多肽的病毒样颗粒，其中所述表面多肽包含(a)来源于靶多肽的暴露于表面的部分，(b)跨膜结构域，和(c)来源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白的胞质尾。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.22 US 61/614,1411.一种包含来源于第一植物包膜病毒的基质蛋白和表面多肽的病毒样颗粒，其中所述第一植物包膜病毒是植物弹状病毒,并且其中所述表面多肽包含:(a)来源于靶多肽的暴露于表面的部分，(b)跨膜结构域，和(c)来源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白的胞质尾；其中所述第一植物包膜病毒和所述第二植物包膜病毒相同。2.权利要求1的病毒样颗粒，其中在植物细胞、植物或植物的部分中产生所述病毒样颗粒。3.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述植物弹状病毒选自莴苣坏死黄化病毒(LNYV)、北方谷物花叶病毒(NCMV)、苦苣菜病毒(SonV)和花椰菜坏死性黄化病毒(BNYV)。4.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述植物弹状病毒是莴苣坏死黄化病毒(LNYV)。5.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述靶多肽是来源于病原体的异源表面抗原。6.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述靶多肽是来源于病毒的异源表面抗原。7.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述表面多肽的暴露于表面的部分具有抗原性。8.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述表面多肽的暴露于表面的部分是治疗性的。9.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述靶多肽是天然表面多肽。10.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述靶多肽是人工表面多肽。11.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述跨膜结构域对于所述暴露于表面的部分是天然的或外来的。12.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述跨膜结构域来源于所述跨膜蛋白。13.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述跨膜结构域来源于细胞或病毒跨膜蛋白。14.一种用于在植物细胞、植物或植物的部分产生病毒样颗粒的方法，包括(a)将一种或多种核酸分子引入植物细胞、植物或植物的部分，其中所述一个或多个核酸分子包含编码来源于第一植物包膜病毒的基质蛋白的第一核苷酸序列和编码表面多肽的第二核苷酸序列，其中所述第一植物包膜病毒是植物弹状病毒，并且其中所述表面多肽包含(i)来源于靶多肽的暴露于表面的部分，(ii)跨膜结构域，和(iii)来源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白的胞质尾；其中所述第一植物包膜病毒和所述第二植物包膜病毒相同；和(b)在允许所述基质蛋白和表面多肽共表达的条件下维持所述植物细胞、植物或植物的部分，由此产生病毒样颗粒。15.权利要求14的方法，其还包括(c)纯化所述病毒样颗粒。16.权利要求14的方法，其中通过渗入、颗粒轰击或接种将所述一种或多种核酸分子引入所述植物细胞、植物或植物的部分。17.权利要求14的方法，其中将所述一种或多种核酸分子瞬时地或稳定地引入植物细胞、植物或植物的部分。18.权利要求14的方法，其中所述植物弹状病毒选自莴苣坏死黄化病毒(LNYV)、北方谷物花叶病毒(NCMV)、苦苣菜病毒(SonV)和花椰菜坏死性黄化病毒(BNYV)。19.权利要求14的方法，其中所述植物弹状病毒是莴苣坏死黄化病毒(LNYV)。20.权利要求14的方法，其中所述靶多肽是...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·普罗奈夫斯基，V·尤什波夫，
申请(专利权)人：弗劳恩霍费尔美国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US