使用具有对水解酶抗性的衣壳的VLP的方法技术

本发明专利技术描述了新方法和组合物，其使用对水解酶抗性的病毒衣壳蛋白质，以制备病毒样颗粒，以便封入目的靶标货物分子并且随后分离且纯化目的靶标货物分子，所述目的靶标货物分子包括核酸例如siRNA和shRNA以及小肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用具有对水解酶抗性的衣壳的VLP的方法与相关申请的交叉参考本专利申请要求于2011年12月21日提交的美国临时申请号61/578,706、于2012年3月7日提交的美国临时申请号61/607,900和于2012年6月19日提交的美国临时申请号61/661,688的优先权，所述美国临时申请的完整公开内容以引用的方式在此并入。序列表的并入“序列表”的纸件拷贝和在软盘上的计算机可读形式的序列表的完整内容以引用的方式并入本文，所述软盘含有命名为450061_SequenceListing_ST25.txt的文件，所述文件大小为77千字节并于2012年12月20日创建。
本专利技术涉及病毒样颗粒，且特别涉及使用病毒衣壳作为纳米容器的方法和组合物，所述纳米容器用于产生、分离且纯化异源核酸和蛋白质。
技术介绍
病毒样颗粒(VLP)是通过某些病毒结构蛋白质的表达而部分源自病毒的颗粒，所述病毒结构蛋白质构成病毒包膜和/或衣壳，但VLP不含病毒基因组并是非感染性的。VLP已例如源自乙型肝炎病毒和某些其他病毒，并且已用于研究病毒装配和疫苗开发中。病毒衣壳由至少一种蛋白质组成，所述蛋白质的几个拷贝装配形成衣壳。在一些病毒中，病毒衣壳由病毒包膜覆盖。此类病毒包膜由病毒糖蛋白和受感染宿主的细胞膜的部分组成，并且使病毒衣壳与否则与其相互作用的大分子屏蔽。衣壳通常被说成使核酸壳体化，所述核酸编码病毒基因组，有时还编码病毒在天然环境中的持续所需的蛋白质。为了病毒的病毒基因组进入新宿主，衣壳必须被拆卸。此类拆卸在通常由宿主用于降解其自身以及外源组分的条件下发生，并且最通常涉及蛋白酶解。病毒利用正常宿主过程例如蛋白酶解降解以激活其周期的关键部分，即衣壳拆卸和基因组释放。因此并不令人惊讶的是，文献先前未描述对作用于肽键的水解酶抗性的衣壳。其为较大蛋白质的一部分的非常有限数目的某些特异性肽序列已知略微对某些蛋白酶是抗性的，但绝大多数的肽序列则不是。抵抗蛋白酶解的病毒已得到报道，但这些均为有包膜病毒，其中衣壳由病毒包膜屏蔽。在此类病毒中，衣壳不与所述蛋白酶接触，即它们被屏蔽免遭所述蛋白酶作用。因此，病毒衣壳在此类情况下的蛋白酶解稳定性的作用(如果存在的话)是未知的。在重组分子例如蛋白质的大规模制造中，超滤通常在纯化步骤中用于去除小于靶蛋白质的分子，从而导致其分离。纯化方法也通常涉及沉淀、溶剂萃取和结晶技术。这些分离技术固有地是简单和低成本的，因为与色谱法形成对比，它们不是基于表面相互作用，而是基于本体相互作用。然而，这些技术通常限制于对简单系统的应用，并且需要指定用于每种蛋白质和表达系统的不同条件组。另外每种靶标重组蛋白质呈现独特的结合相互作用组，由此使得它的分离过程是独特和复杂的。使用这些简单分离过程对于重组蛋白质的分离效率因此很低。核酸包括siRNA和miRNA大部分已使用化学合成方法制造。由于所需的大量步骤和倾向于技术困难的反应的复杂性以及制造系统的成本，这些方法一般是复杂和高成本的。另外，涉及的合成试剂是昂贵的，并且因此规模经济不容易通过简单增加分批大小来获得。
技术实现思路
在一个方面，本公开内容提供了病毒样颗粒(VLP)，其包含封入至少一种异源货物(cargo)分子和包装序列的衣壳。VLP还可包含由衣壳封入的至少一种核酶。异源货物分子可包含寡核苷酸或寡核糖核苷酸。VLP可包含一种或多种核酶，并且核酶的侧翼可以是包装序列和寡核糖核苷酸，以形成核酸构建体。VLP可包含多个核酸构建体。在包含寡核糖核苷酸的VLP中，寡核糖核苷酸可以是选自siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA和miRNA的短RNA。VLP可包含至少两种核酶，其中每种核酶选择为切割短RNA的一个末端。VLP还可包含由至少1-100个核苷酸组成的接头，该接头包含至少40％的A或至少40％的U，其中该接头连接寡核糖核苷酸和包装序列、或寡核糖核苷酸和核酶。核酶可选自例如锤头状核酶和丁型肝炎病毒核酶。锤头状核酶可以是具有与寡核糖核苷酸的至少6个连续核苷酸互补的连续核苷酸组的锤头状核酶变体。作为另外一种选择，核酶可以是能够切割其与寡核糖核苷酸的连接的突变型丁型肝炎病毒核酶，其速率为野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多约50％。此类突变型HDV核酶可具有例如选自SEQIDNo：10-18的核酸序列。根据本公开内容的VLP可包括包含野生型病毒衣壳或衣壳蛋白质的衣壳，所述野生型病毒衣壳对由肽键水解酶类别EC3.4催化的水解是抗性的，所述衣壳蛋白质与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳(SEQIDNO:3)的氨基酸序列具有至少15％、至少16％、至少21％、至少40％、至少41％、至少45％、至少52％、至少53％、至少56％、至少59％或至少86％序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC3.4催化的水解是抗性的。该衣壳可包含具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质。根据本公开内容的VLP可包含包括肽或多肽的异源货物分子。VLP还可包含偶联异源货物肽或多肽分子和病毒衣壳的寡核苷酸接头。寡核苷酸接头可以是包含核酶序列的寡核糖核苷酸。作为另外一种选择，异源货物分子可包括包含双功能多核苷酸的双分子货物分子，所述双功能多核苷酸包含第一适体序列和第二适体序列，所述第一适体序列特异性结合具有约1,500Da或更少的分子量的生物活性小分子，所述第二适体序列用于结合衣壳的包装序列。VLP还可包含与第一适体序列结合的生物活性小分子。生物活性小分子可包含除草剂或杀虫剂，所述除草剂或杀虫剂可选自例如莠去津、啶虫脒甲拌磷(acetamipridphorate)、丙溴磷、水胺硫磷和氧乐果(omethoateas)。在另一个方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸构建体，所述核苷酸序列编码短RNA、核酶和包装序列。短RNA可以例如是siRNA或shRNA。核酸构建体还可包含4-100个核苷酸的连接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40％是A或至少40％是T，其中该连接核苷酸序列的侧翼为包装编码序列和短RNA编码序列。核酸构建体还可包含4-100个核苷酸的连接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40％是A或至少40％是U，其中该连接核苷酸序列的侧翼为核酶和短RNA编码序列。核酶序列的侧翼可以为短RNA和包装序列。本公开内容还包括包含任何此类核酸构建体的载体，和包含此类载体的宿主细胞，以及由此类载体稳定转化的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞，例如但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或酵母细胞。宿主细胞还可由第二载体稳定转染，所述第二载体包含编码病毒衣壳的第二核酸序列，所述病毒衣壳对由肽键水解酶类别EC3.4催化的水解是抗性的。第二核酸序列可编码例如编码病毒衣壳的病毒蛋白质，所述病毒衣壳与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质(SEQIDNO:3)的氨基酸序列具有至少40％序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC3.4催化的水解是抗性的。如本文描述的核酸构建体还可编码野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质(SEQIDNO:3)。此类核酸构建体中的核酶可以是例如锤头状核酶、具有与短RNA的至少6个连续核苷酸互补的连续核苷酸组的锤头状核酶变体、丁型肝炎病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种病毒样颗粒(VLP)，所述病毒样颗粒包含封入至少一种异源货物分子和包装序列的衣壳。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.21 US 61/578,706;2012.03.07 US 61/607,900;1.一种用于纯化封入至少一种异源货物分子的、由SEQIDNO:3所示的肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质组成的VLP的方法，所述方法包括：(a)获得包含多个所述VLP的细胞裂解物；(b)使所述细胞裂解物与蛋白酶接触足以水解除所述VLP外的细胞裂解产物的时间和条件，以形成水解产物；和(c)从所述水解产物中分离所述VLP。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶是肽键水解酶类别EC3.4。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶选自蛋白酶K、来自灰色链霉菌的蛋白酶、来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)执行约30分钟。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)在约37℃下执行。6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)还包括使所述细胞裂解物与核酸酶、淀粉酶和脂肪酶中的至少一种接触。7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括使所述水解产物离心，以获得包含按重量计至少90％的所述VLP的沉淀物。8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括(i)执行使用硫酸铵的所述水解产物的第一沉淀，随后为第一离心，以获得第一沉淀物和第一上清液；和(ii)对所述第一上清液执行使用硫酸铵的第二沉淀，随后为第二离心，以获得第二沉淀物，其中所述第二沉淀物包含按重量计至少90％的所述VLP。9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括(i)执行使用乙醇的所述水解产物的第一沉淀，随后为第一离心，以获得第一沉淀物和第一上清液；和(ii)对所述第一上清液执行使用硫酸铵的第二沉淀，随后为第二离心，以获得第二沉淀物，其中所述第二沉淀物包含按重量计至少90％的所述VLP。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源货物分子包含偶联所述异源货物分子和所述VLP的寡核苷酸接头。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述寡核苷酸接头是寡核糖核苷酸。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源货物分子包括选自siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA和miRNA的寡核糖核苷酸。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源货物分子包括包含核酶的寡核糖核苷酸。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源货物分子包括肽或多肽。15.根据权利要求1所述的方法，其中从所述水解产物中分离的所述VLP包含对于所述细胞裂解物中存在的每100克衣壳蛋白质小于4克的一种或多种细胞裂解产物，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡安·彼得罗·亨伯图·阿汉塞特，胡安·P·阿汉塞特，金伯利·德莱尼，凯思琳·B·霍尔，尼纳·萨默斯，
申请(专利权)人：阿普斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US