本发明专利技术公开了一种甲型H9N2流感病毒血凝素蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒。该试剂盒包含有包被单克隆抗体的固相载体，辣根过氧化物酶标记的兔多克隆抗体、H9N2血凝素蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、底物显色液和反应终止液，不但灵敏度好，可以对H9N2流感病毒血凝素蛋白进行定量检测，而且特异性识别甲型H9N2流感病毒，与甲型流感病毒的其它主要亚型包括H1N1，H2N2，H3N2，H5N1和H7N7以及乙型流感病毒的血凝素蛋白无交叉反应。试剂盒操作简单，能够同时快速检测大批样本，既可以用于支持H9N2流感病毒的基础研究，同时，对于开展流感病毒的流行病学研究具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及H9N2流感病毒血凝素蛋白特异性单克隆抗体 制备，W及一种定量H9N2流感病毒血凝素蛋白双抗夹也化ISA检测试剂盒。
技术介绍
禽流感是一种由禽流感病毒引起的疾病，所表现的临床症状随病毒亚型不同而 异。至今已发现的甲型流感病毒的血凝素16个亚型化1~化6)和神经氨酸酶9个亚型 (N1~N9)均能从禽中分离到，但它们并不是都能引起禽流感。目前发现能感染人的禽流感 病毒主要有；册N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3 和 H7N9 亚型。 H9N2是一种禽流感病毒，属于正黏病毒科A型流感病毒属。1966年化Mee从患温 和呼吸道病的火鸡中分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒，之后H9N2亚型禽流感在世界范 围内迅速流行，尤其是1994~1999年在世界范围内造成了巨大的经济损失。近几年，对我 国部分省市鸡场进行的禽流感血清学调查中发现，221个禽流感阳性鸡群中H9亚型阳性鸡 群占阳性群总数的93. 67%，证实了 H9N2亚型禽流感在我国广泛存在，是当前禽流感流行 的主要亚型。研究表明，近年来H9N2亚型部分流行株的致病力明显变异，尤其对肉仔鸡，死 亡率可达到30% W上；对产蛋高峰期的蛋鸡，其产蛋下降幅度大，恢复困难，因此对养禽业 有巨大危害。 H9N2病毒在人类身上发现比较罕见，可W感染人但一般不致人死亡，主要传染源 为禽类，在人群中不易传播。1998年广东省的流感监测系统在韶关、灿头市分别发现4例和 5例H9N2禽流感病毒感染病例，为全球首次发现人H9N2感染病例。W前认为禽流感和人是 有种属屏障的，但近几年的禽流感感染人事件表明，该种屏障正在减弱或消失看，而且禽流 感不仅在鸡、鸭、鶴、候鸟等禽类上发生，目前已经开始波及到猪、老虎、海狮等哺乳类动物， 因此潜在危害性不断加大。 H9N2禽流感病毒亚型毒性虽然弱于册N1亚型，人群发病率低，但近年来，随着传 染源愈来愈多，感染谱逐渐扩大，W及非典型性禽流感流行增多，给禽流感的消灭和控制带 来了巨大困难，H9N2发生变异导致致病性增加和人际传播，引发严重流感疫情的可能性一 直存在，因此人类在高度警惕册N1的同时，也不能忽视H9N2的威胁。 综上所述，H9N2不但严重危害养殖业的发展，其公共卫生意义也日渐显著。对 H9N2的检测，在减少世界经济损失和提高人类卫生健康方面，都具有深远的意义。目前 H9N2还是W基于核酸检测的定量PCR方法为主，该种方法对环境，样品W及仪器要求较高， 需要专业人员操作，不易推广。另外，现有的基于化ISA原理的H9N2检测试剂，缺点是无法 进行定量检测，而且针对不同流感病毒亚型的检测特异性差，因此亟需一种操作简单，灵敏 度好，特异性高的定量检测试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测灵敏度高、准确性强、低成本的H9N2流感病毒血凝 素蛋白双抗夹也法检测试剂盒。 本专利技术所提供的检测试剂盒包括包含有包被单克隆抗体的固相载体，酶标检测多 克隆抗体W及蛋白标准品、样品稀释液、洗涂液、底物显色液和反应终止液。 其中所述包被单克隆抗体为鼠单克隆抗体，其轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID N0;1和SEQ ID N0;2;所述酶标检测多克隆抗体为辣根过氧化物酶Olorseradish peroxidase, HR巧标记的兔多克隆抗体；所述蛋白标准品为重组H9N2流感病毒血凝素蛋 白。 所述鼠单克隆抗体采用重组H9N2流感病毒血凝素蛋白免疫动物，然后选择高血 清效价小鼠通过经典杂交瘤技术制备获得；所述酶标兔多克隆抗体采用H9N2流感病毒血 凝素蛋白免疫动物，通过蛋白A纯化和抗原亲和纯化技术制备纯化的多克隆抗体，然后按 照常规方法利用HRP标记抗体获得。 本专利技术的技术方案为优选具有高灵敏度、高特异性的单克隆抗体与酶标多克隆 抗体配对组合，将单克隆抗体作为包被抗体吸附于固相载体上，包被抗体可W特异性的捕 获样本中的H9N2流感病毒血凝素蛋白W及蛋白标准品，加入酶标检测抗体后，形成包被抗 体、抗原、检测抗体复合物，相应底物显色后终止，读取样本吸光值，通过与标准曲线比较即 可得出样本中H9N2流感血凝素蛋白的含量。 血凝素蛋白是流感病毒感染宿主细胞的关键功能蛋白，同时，也是流感治疗性药 物及疫苗开发的重要祀点，本专利技术采用双抗夹也法，能够定性或定量检测样本中的甲型 H9N2流感血凝素蛋白水平，检验方法方便易行，检测灵敏度和准确度高、特异性强、能够同 时快速检测大批样本，作为试剂盒关键组成部分的包被和检测抗体均为自主研发，因此成 本低，可靠性强，易溯源，预计将在H9N2的相关基础和临床研究中发挥重要作用。【附图说明】 图1. H9N2流感病毒血凝素蛋白ELISA试剂盒标准曲线图【具体实施方式】 W下结合具体实施例对本专利技术做进一步的描述和说明。 实施例1H9N2流感血凝素蛋白ELISA试剂盒的组分制备 1.小鼠单克隆抗体的制备： 1)动物免疫[001引采用Ba化/c小鼠作为免疫动物，W义翅神州生物技术有限公司生产的重组H9N2 流感血凝素蛋白（货号；11229-V08H)为免疫原，免疫剂量为每次每只小鼠免疫50yg的蛋 白。首次免疫时将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射，间隔2~ 3周后取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫两次，H次免疫后使 用间接化ISA法测定血清效价，血清效价达到1 : 16000 W后，选择效价最高的小鼠腹腔加 强免疫一次，4天后取脾细胞进行细胞融合。 2)细胞融合和克隆化 取小鼠脾脏，研磨过滤后离也获得单个脾细胞息液，细胞计数后，按5 : 1或 10 : 1的比例与处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，采用聚己二醇（PEG)法进 行细胞融合，铺板，通过选择培养基的作用，骨髓瘤细胞和脾细胞等未融合或未有效融合的 细胞将无法生长，而有效融合的杂交瘤细胞将在培养孔内生长、增殖，并分泌抗体。H次换 液后，融合后第9-12天取细胞培养上清，W重组H9N2流感血凝素蛋白作为包被抗原，利用 间接ELISA法测定上清液，筛选阳性孔，并通过有限稀释法对阳性细胞进行克隆化培养，直 至得到稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。W上细胞融合和克隆化方法均为免疫 学单克隆抗体技术中的常用经典方法。 3)单克隆抗体的生产与纯化 选取杂交瘤细胞株，利用培养瓶或生物反应器进行细胞培养，收集细胞培养上清， 利用常规蛋白A亲和层析柱进行纯化，获得的抗体通过SDS-PAGE电泳和间接化ISA法鉴定 抗体纯度和特异性后分装，于-2(TC低温保存备用。 4)单克隆抗体的序列测定 杂交瘤细胞长期保存可能由于多次传代后不稳定W及污染问题导致阳性克隆丢 失，为解决上述问题，在本专利技术过程中，利用分子生物学技术分别提取了阳性克隆的抗体轻 链和重链基因，进行了序列测定，包含有抗体基因的质粒可W在-2(TC条件下长期稳定保 存，同时，根据抗体基因序列，本专业领域内的技术人员可W按照常规分子生物学方法克隆 表达获得相同的单克隆抗体。抗体基因提取具体方法如下：收集生长状态良好的杂交瘤细胞，按BBI公司的 classical total RNA isolation kit说本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测H9N2流感病毒血凝素蛋白的ELISA试剂盒，其包括：1)包被H9N2流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的酶标板；2)酶标记的H9N2流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体；其中，所述用于包被酶标板的H9N2流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述酶标记的H9N2流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的兔多克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢良志，罗春霞，孙春昀，张杰，李东，张延静，李雁，王加兰，
申请(专利权)人：北京义翘神州生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。