本发明专利技术公开百日咳和副百日咳杆菌药物靶点筛选方法，根据反向疫苗学理论和构建百日咳杆菌和副百日咳杆菌的蛋白质相互作用网络筛选针对二者的交叉保护抗原和药物靶点。应用反向疫苗学理论和生物信息学方法以及DNA芯片数据从3436个ORFs中初步筛选到最后191个候选抗原。它们都符合以下标准：（1）在百日咳杆菌和副百日咳杆菌都高度表达，或者与百日咳的致病和毒力密切相关；（2）都暴露在细菌的表面；（3）不与宿主同源，不会对宿主产生危害；（4）在165株百日咳杆菌和副百日咳杆菌中高度保守。这大大减少了实验的工作量和时间，并将直接促进百日咳新疫苗的发展。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌的疫苗抗原筛选领域，更具体地讲，涉及。
技术介绍
过去20年中，百日咳是儿童普遍接受疫苗接种后发病率持续增加的唯一疾病。尽管免疫接种有效地控制了百日咳的流行，但过去的10年中，全球百日咳发病率仍然出现了明显上升的趋势，尤其在疫苗覆盖率较高的发达国家，如澳大利亚、法国、德国、荷兰、新西兰、英国、美国、波兰等，频频有百日咳局部爆发或流行的报道，称之为百日咳的再现。导致百日咳再现的原因可能包括疫苗株和流行株的差异、流行株对疫苗的变异等，其中还有一个重要的原因是当前使用的百日咳疫苗对越来越多的副百日咳杆菌感染病人没有保护力或是保护力不够。因此急需要提高百日咳疫苗的保护效力。反向疫苗学是2000年新发展的一个疫苗研究技术。反向疫苗学成功应用的第一个典范是B型脑膜炎奈瑟菌疫苗。它的整个实验流程如下:首先对B型脑膜炎奈瑟菌进行全基因组测序，从预测出来的2158个开放阅读框(ORFs)中再用生物信息学软件如BLAST和PSORT等筛选出600个ORFs，分别属于外膜或分泌蛋白、脂蛋白、内膜蛋白、周质蛋白以及与毒力和致病性有关的细菌因子的相似蛋白，PCR扩增，克隆，在大肠杆菌中成功表达了 350个ORFs，将表达产物纯化后免疫小鼠，有29种能刺激机体产生抗体。在这29种蛋白中，有5种候选抗原在世界各地31株B型脑膜炎奈瑟菌不同血清群中保守，动物实验表明这5种候选抗原能对抗多种B型脑膜炎奈瑟菌不同血清群的攻击，从而成功的研制出B型脑膜炎奈瑟菌疫苗。随后反向疫苗学在肺炎链球菌、在肺炎衣原体菌和金黄色葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌等疫苗研究中广泛应用起来。对细菌表面暴露蛋白的筛选是反向疫苗学整个研究策略的第一步也是最关键的一步。预测细菌亚细胞定位的软件如PSORT、P_CLASSIFIER和Proteome Analyst在疫苗研究中已经得到了广泛的应用。此外，预测信号肽的软件SignlP，预测跨膜结构的TMHMM，还有BLAST等生物信息学软件在疫苗领域尤其是反向疫苗学领域使用也相当普遍。虽然利用生物信息学方法筛选细菌的表面暴露蛋白的优点很多，比如，高通量，快速便捷，无需实验，省时省力。但是它最大的一个缺陷是不能确定某个疫苗候选抗原是否表达以及表达量的高低。反向疫苗学研究往往都是只选择一种单一的生物信息学方法。到目前为止，常用的预测细菌亚细胞定位的软件有 7 种:PS0RT、CELLO、LOCtree, PSLprecU SubLoc, P-CLASSIFIER和Proteome Analyst。根据各自不同的算法,每一种方法都有各自的优势和偏向性。根据nature microb1logy review的最新的一项研究表明在革兰氏阴性菌的5种亚细胞定位中，细胞胞质蛋白和内膜蛋白预测是最准确，也是最可信的。其次PSORTB是7种方法中预测最准确，因为许多低可信度的预测结果都被PSORTB定义为unknown蛋白。比如在百日咳杆菌的3436个ORF中，有1561个，超过40%的蛋白都被预测为unknown蛋白。通常的的反向疫苗学筛选策略是选择某种预测细菌亚细胞定位的方法去筛选表面暴露蛋白，往往忽视了这些unknown蛋白，这些未知的蛋白也很有可能是适合的候选抗原。百日咳疫苗的最重要的成分百日咳毒素就被PSORTB预测为unknown蛋白。如何整合目前多种生物信息学预测软件避免去掉了潜在的疫苗候选抗原是反向疫苗学中一个急待解决的难题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供，根据反向疫苗学理论和构建百日咳杆菌和副百日咳杆菌的蛋白质相互作用网络筛选针对二者的交叉保护抗原和药物靶点。本专利技术的第二个目的在于提供百日咳和副百日咳杆菌药物靶点。为实现本专利技术第一个专利技术目的，本专利技术提供，其特征在于，包括以下步骤: (1)挑选百日咳杆菌和副百日咳杆菌的基因表达谱鉴定出来的高度表达基因和致病因子或毒力因子作为初步的疫苗候选抗原，所述高度表达基因是指相对荧光信号值超过整个芯片所有杂交点的荧光信号强度的中值，就相当于这个基因在每个细胞至少有10 -20mRNA分子拷贝数； (2)选择细菌胞质蛋白和跨膜结构超过4个的内膜蛋白，并且胞质蛋白被SignalP3.0预测无信号肽，被TMHMM预测没有跨膜结构；内膜蛋白的跨膜结构数目也是由TMHMM鉴定； (3)以人的全部蛋白质序列为数据库，使用BLASTP程序，用百日咳杆菌全部蛋白质序列和人的全部蛋白质序列进行比对，确定两个蛋白同源的标准是E-value值低于le_10,以及同源序列不能低于蛋白序列的总长的30%。为实现本专利技术第二个专利技术目的，本专利技术提供上述筛选方法获得的百日咳和副百日咳杆菌药物靶点，所述药物靶点是指青霉素结合蛋白1A，50S核糖体蛋白L33亚基和Hu-PDNA结合蛋白。本专利技术的优点在于:通过常规的实验方法从百日咳杆菌3436个ORFs中筛选针对副百日咳杆菌交叉保护抗原将是一件艰巨的任务。我们应用反向疫苗学理论和生物信息学方法以及DNA芯片数据从3436个ORFs中初步筛选到最后191个候选抗原。它们都符合以下标准:(I)在百日咳杆菌和副百日咳杆菌都高度表达，或者与百日咳的致病和毒力密切相关；(2)都暴露在细菌的表面；(3)不与宿主同源，不会对宿主产生危害；(4)在165株百日咳杆菌和副百日咳杆菌中高度保守。这大大减少了实验的工作量和时间，并有可能直接促进百日咳新疫苗的发展。【具体实施方式】下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1. 1、选择在百日咳杆菌GMT — I菌株和副百日咳杆菌12822菌株中都高度表达的基因和存在于副百日咳杆菌基因组中的百日咳杆菌的菌株中都高度表达的基因和存在于副百日咳杆菌基因组中的百日咳杆菌的37°C表达上调基因作为初步的候选抗原。高度表达基因一般被认为是那些相对荧光信号值超过整个芯片所有杂交点的荧光信号强度的中值，就相当于这个基因在每个细胞至少有10 — 20mRNA分子拷贝数。(2)根据反向疫苗学的理论，除了细菌胞质蛋白外，其他四种亚细胞定位的蛋白包括内I旲蛋白、周质蛋白、外I旲蛋白和分泌蛋白都有可能引起宿王广生免疫反应，当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
百日咳和副百日咳杆菌药物靶点筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）挑选百日咳杆菌和副百日咳杆菌的基因表达谱鉴定出来的高度表达基因和致病因子或毒力因子作为初步的疫苗候选抗原，所述高度表达基因是指相对荧光信号值超过整个芯片所有杂交点的荧光信号强度的中值，就相当于这个基因在每个细胞至少有 10－20mRNA 分子拷贝数；（2）选择细菌胞质蛋白和跨膜结构超过4个的内膜蛋白，并且胞质蛋白被SignalP 3.0预测无信号肽，被TMHMM预测没有跨膜结构；内膜蛋白的跨膜结构数目也是由TMHMM鉴定；（3）以人的全部蛋白质序列为数据库，使用BLASTP程序，用百日咳杆菌全部蛋白质序列和人的全部蛋白质序列进行比对，确定两个蛋白同源的标准是E‑value值低于1e‑10,以及同源序列不能低于蛋白序列的总长的30%。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱泳璋，李擎天，马广源，
申请(专利权)人：朱泳璋，无锡市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。