一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法技术
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药
，涉及一种检测未知化合物与药物靶点的结合分子动力学特征的检测方法，具体涉及一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法。
技术介绍
药物受体结合的保留时间是一项近年来新兴的分子结合动力学概念。此概念定义为药物与受体结合后，两者形成复合体的存在时间。测定药物与靶点结合的分子动力学特征，在早期的药物设计与筛选过程中具有重要的意义。研究表明，优化药物在靶点上的停留时间可以改善药物的临床药效或者药物的毒性：针对药物作用的靶点，长停留时间的药物可以表现出更高，更持久的药效，而对于其他非药物作用靶点，具有短停留时间的药物可以有效的避免脱靶效应，减少药物产生的毒性。因此，建立新的检测方法，测定未知化合物的分子动力学特征，能够为早期的药物设计与筛选提供重要的工具。目前，国内外对于药物受体结合的分子动力学研究，已经取得了一定的进展，包括一系列检测方法的建立。现阶段分子动力学研究主要是依靠制备重组细胞膜，然后通过测定同位素标记的待测物在受体上的结合速率和离解速率。即将具有高度表达药物靶点的细胞收集并分散打碎后，在制备的细胞膜系统上测定药物受体分子动力学特征。...
【技术保护点】
一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法，其方法步骤特征为：（1）体外培养并收集重组细胞或者组织分离的动物细胞，分成三份，分别标记为a组、b组、c组；（2）将a组细胞分成12个小组，每小组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞；将上述细胞分散在含有50mM三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3‑[3‑(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中，使a组细胞与放射性同位素标记的标准物在室温孵育20分钟；孵育20分钟后，向a组的1‑11小组的反应容器中加入高浓度的未被同位素标记的取代物，并将1‑11小组的...
【技术特征摘要】
1.一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法，其方法步骤特征为：（1）体外培养并收集重组细胞或者组织分离的动物细胞，分成三份，分别标记为a组、b组、c组；（2）将a组细胞分成12个小组，每小组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞；将上述细胞分散在含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM氯化镁、0.1%(w/v)3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中，使a组细胞与放射性同位素标记的标准物在室温孵育20分钟；孵育20分钟后，向a组的1-11小组的反应容器中加入高浓度的未被同位素标记的取代物，并将1-11小组的细胞混合液分别对应孵育不同的时间，即第1小组孵育0.5分钟,第2小组1分钟,第3小组2分钟,第4小组4分钟,第5小组8分钟,第6小组10分钟,第7小组12分钟,第8小组15分钟,第9小组20分钟,第10小组30分钟,第11小组60分钟，以启动同位素标记的标准物的离解过程；a组的第12小组的细胞在孵育20分钟结束后，直接加入高浓度的未被同位素标记的竞争取代物，孵育60分钟后测量标准物的非特异性同位素结合强弱；待a组细胞孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将1-12不同小组中的细胞收集在滤膜上，并使用含有三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、氯化镁的洗脱液，分离游离态与结合态的放射性同位素标记的标准物，所得滤膜加入闪烁液后，用闪烁光谱法测定标准物的放射性，之后利用单相离解速率模型计算同位素标记的标准物的离解速率常数；（3）将b组细胞分成12个小组，每组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞，分散在含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM氯化镁、0.1%(w/v)3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中，之后将放射性同位素标记的标准物加入到b组的1-11小组的反应容器中进行孵育，即第1小组孵育0.5分钟,第2小组1分钟,第3小组2分钟,第4小组4分钟,第5小组8分钟,第6小组10分钟,第7小组12分钟,第8小组15分钟,第9小组20分钟,第10小组30分钟,第11小组60分钟；孵育结束后测量放射性同位素标记的标准物在不同的孵育时间段与细胞的结合强度；在b组的第12小组反应容器中加入放射性同位素标记的标准物的同时，加入高浓度的未被同位素标记的竞争取代物，并在孵育60分钟后测量第12小组反应容器中标准物非特异性的放射性结合强度；待b组细胞全部孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将1-12不...
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