本发明专利技术提供了一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，属于生物医药领域。该模型利用含有NF-κB特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型NF-kB的活性细胞为基础构建而成，用于筛选由NF-κB组成型活化造成的肿瘤及免疫疾病的治疗药物。由于采用具有组成型NF-κB活性的细胞，模型细胞中报告基因处于高度活化状态，无需使用外加刺激物，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选，不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从细胞培养→激活NF-κB→加化合物→检测简化为：细胞培养→加化合物→检测，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升了系统的稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。
【技术实现步骤摘要】
以NF-k B为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种以NF-K B为靶点的药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有组成型NF-κ B活性细胞为基础的药物筛选细胞模型；本专利技术同时还涉及该药物筛选细胞模型的构建方法和应用。
技术介绍
因 ^ - κ B (NF- κ B ，nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)是重要的转录因子，主要包括 RelA (p65)、RelB、c_Rel、p50 和 p52，通常NF-κΒ以同源或者异源二聚体的形式存在，其中p65/p50 二聚体是最常见的 NF-kB形式。正常情况NF-K B下参与了多种生理反应，如与细胞粘附、分化、凋亡、细胞外基质的降解、炎性细胞趋化、免疫激活等等基因。多种因素可以激活NF-κ B而引发下游反应，包括多种细胞因子(如肿瘤坏死因子TNF α及白细胞介素IL-Ιβ等)、应激刺激、LPS(脂多糖)、病毒或其它外源核酸、自由基等等。在经典的通路中，NF-K B 二聚体由于结合了其抑制蛋白lKB(Inhibitor of NF-κ B)而大部分滞留在细胞质中，外加刺激或病理情况下 (诸如上述诱导因素)由于IkB被过量降解而导致NF-KB活化入核，行使一系列功能；同时近些年的研究表明NF-K B 二聚体如ρ65/ρ50可以在与其它一些蛋白结合的过程中被活化行使功能(如STAT3)。NF-KB是迄今少数几个研究比较透彻、且公认的在疾病中扮演重要角色的关键分子之一。异常活化的NF-K B活性通常与肿瘤发生、发展及转移，免疫异常诸如关节炎、自身免疫、哮喘、某些心脏病等疾病相关。研究发现，在许多类型的肿瘤中，像乳腺癌、结肠癌、前列腺癌，恶性淋巴瘤细胞等等，都有持续活化的NF- κ B活性。研究表明，在这一类肿瘤细胞中，抑制NF-K B活性将有效的降低肿瘤细胞的存活、增殖等过程，有效地降低其恶性程度； 因此，抑制NF-κ B的活性自然成为减缓和治疗免疫系统疾病的重要方案之一(Wang等人 Science 1996 ； Wu 等人EMB0 J 1996 ；Wang 等人Nat Med 1999，Yamamoto 等人 J Biol Chem 1999 ;Yamamoto 等人Curr Mol Med 2001 ；Yamamoto 等人 J Clin Invest 2001)。基于上述原因，一直以来研究者们试图寻找特异性好，副作用低的NF-K B抑制剂，以最终用于临床，缓解和治疗数目庞大的相关患者。然而时至今日理想的产品少之又少，很大程度缘于没有一套高效而简易的筛选方法。基于报告系统的高通量筛选方法虽已经出现并用于实践，并取得了一定成效，但仍然有一些不可克服的缺点，比如需要外源刺激 (先用激活剂激活NF- κ B,再去筛选抑制剂)，这样不仅筛选步骤多，而且筛选成本也较高， 尤其是像细胞因子IL-I β和TNFa等激活剂的使用将大大增高成本；即使像LPS类激活剂使用成本较低，但由于其本身毒性较大，限制了其使用；同时筛选体系每增加一步，会使报告系统的不稳定性增加(额外的操作必然会带来额外的不确定因素)。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种以NF- κ B为靶点的药物筛选细胞模型。本专利技术的另一目的是提供一种以NF-K B为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法。本专利技术还有一个目的，就是提供一种以NF- κ B为靶点的药物筛选细胞模型在药物筛选中的应用。(一)以NF-κ B为靶点的药物筛选细胞模型药物筛选细胞模型本专利技术以NF- κ B为靶点的药物筛选细胞模型，是利用含有NF- κ B特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型NF-kB的活性细胞为基础，构建成稳定的以NF- κ B信号为靶点高通量药物筛选细胞模型。所述NF-κ B的特异性结合序列为5’ -GGGRNNYYCC-3，；其中R为嘌呤，Y为嘧啶，N 为碱基。所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有NF- κ B特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。所述具有组成型NF-K B活性细胞，为一类具有持续活化NF-K B活性的细胞，包括DU145，前列腺癌细胞、H印G2，人肝癌细胞、Hl299人肺癌细胞、A549人肺癌细胞、HCTl 19 人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-468人乳腺癌细胞或 MDA-MB-231人乳腺癌细胞等等。(二)以NF- K B为靶点的药物筛选细胞模型的构建本专利技术以NF-K B为靶点的药物筛选细胞模型的构建包括以下工艺步骤 (1)报告系统载体构建利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有NF-κ B特异性结合序列以及3’端含有TATA盒序列的DNA片段， 作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当NF-K B活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；抑制NF- κ B活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的水平都降低，也就抑制细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就减弱。(2)细胞模型的构建将报告系统载体转染具有组成型NF-K B活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对已知NF-K B信号抑制剂(如TPCA-1，Bayl 1-7082等已知 NF-kB上游信号抑制剂)有响应的克隆，即为以NF-K B为靶点的药物筛选细胞模型。在具有组成型NF-K B活性的细胞中，报告系统载体能很好地被活化，当使用 NF- κ B信号通路抑制剂时即可使荧光被显著抑制，构建的细胞模型也就无需在外源刺激下灵敏地用于高通量药物筛选。(三)以NF-κ B为靶点的药物筛选细胞模型的应用本专利技术以NF- κ B为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由NF- κ B组成型活化造成的肿瘤及免疫疾病的治疗药物。具体筛选药物的方法如下(1)将所述药物筛选细胞模型用100μ 1培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为 30% 40% ；(2)在培养基中加入待筛选化合物0.1μ广2μl，继续培养 小时；(3)在96孔板中加入50μ 1稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；(4)以化合物细胞毒性实验消除化合物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率达仍在40% 以上得到复筛产物，即为以NF-K B为靶点的抑制药物。本专利技术相对于现有技术具有以下优点以NF-K B信号通路为靶点，采用基于具有组成型NF- κ B活性(即持续NF- κ B活性)的细胞系为策略，使报告系统本身在细胞中处于高度活化状态，无需使用外加刺激，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选，不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从细胞培养一激活NF-K B —加化合物一检测简化为细胞培养一加化合物一检测，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升了系统的稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。附图本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王勤，杨金波，杜宇平，陈星，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：
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