以2-Cys Prx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法技术

一种以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法，该方法包括构建含马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx基因的重组表达质粒pET41b-DdPrx；将重组表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，通过IPTG诱导培养以稳定表达重组Dd-PRX蛋白；将候选化合物与重组DdPrx蛋白共孵育，根据硫氰酸铁法检测候选化合物是否对重组DdPrx蛋白具有离体抑制活性。本方法具有直接、简便、快速等优点，既可用于手工筛选，又可用于大规模高通量抑制剂的筛选。本方法能用于研发筛选抗植物线虫侵染药物。

【技术实现步骤摘要】
以2-CysPrx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法
本专利技术涉及植物寄生线虫杀虫剂领域，具体涉及以2-Cys型过氧化物还原酶(Peroxiredoxins,Prx)即2-CysPrx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法。
技术介绍
植物寄生线虫是引起植物病害的重要病原物之一。在全球范围内，植物病原线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的演化而日益严重，已成为农业生物灾害中继昆虫、植物病害之后的第三大灾害。据报道，严重危害我国农、林、经济作物等的线虫达100多种。植物寄生线虫每年对全世界农作物的产量损失大约为1250亿美元。目前防治线虫的方法主要是通过栽培技术、作物轮作、抗性品种的选择，结合使用一些现在仍批准使用的化学杀线虫剂。杀线虫剂是伴随着线虫危害的日益严重而诞生的，虽然这些化学药剂对线虫防治起到了积极作用，但我国现有防治线虫病害的药剂品种少，可供选择性不强，有关杀线虫剂的研究和开发，无论是理论研究和技术开发上，都还是农药领域中非常薄弱的部分，杀线虫的活性成分和作用机制方面研究较少。因为环境压力，植物寄生线虫的化学防治方法的发展受到严峻的挑战。开发新型、低毒、高效杀线虫剂势在必行。植物线虫抗氧化系统机制的深入研究为药物靶点的开发和利用提供了理论依据和新的切入点。生物在有氧代谢过程中普遍产生活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)，为了抵抗ROS的损伤，生物在长期的进化过程中，形成了谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxudase,GPx)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、过氧化物还原酶(peroxiredoxins,Prxs)等各种抗氧化系统。为及时清除过多的内源性活性氧族及其周围环境包括寄主产生的外源性ROS的损害，植物线虫体内同样也存在各种抗氧化系统，使之维持在一个正常的水平。例如，在植物病原物侵染寄主过程中，植物通过产生过氧化物来抵御病原物的入侵，线虫等病原物则通过分泌抗氧化酶来清除其毒害。作为抗氧化酶家族中的一员，过氧化物还原酶基因广泛存在于原核生物和真核生物中。目前已发现的Prx功能除了保持ROS平衡，使机体免受DNA损伤，蛋白变性及脂类过氧化等伤害外，还参与细胞凋亡、增殖、分化、细胞内信号传递以及基因表达调控等多种生物功能。随着对Prxs研究的不断深入，将Prxs作为潜在的药物、疫苗或诊断靶标正受到越来越多的关注和研究。近年来对Prxs应用的研究主要集中在药物、疫苗或诊断目标三个方面，其中以Prx作为抗原进行疫苗研制及Prx与肿瘤的关系方面研究较多。在以Prx作为抗原的研究中，国外更是已有相关专利的报道，如，马来丝虫(Brugiamalayi)Prx6作为疫苗抗原已经申请美国专利(U.S.Patent6,352,836)；杜氏利什曼原虫(L.donovani)Prx1a作为一种疫苗抗原候选物已经申请了美国专利(U.S.Patent7795406)，而以Prx为靶标进行防治植物线虫药物研制的报道目前还比较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种用于以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点进行抗植物线虫侵染化合物筛选的重组表达质粒，该重组表达质粒为pET41b-DdPrx。本专利技术同时提供一种以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法，该方法包括如下步骤：a、构建含马铃薯腐烂茎线虫2-CysPrx基因的重组表达质粒pET41b-DdPrx；b、将重组表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，通过IPTG诱导培养以稳定表达重组Dd-PRX蛋白；所述重组Dd-PRX蛋白为马铃薯腐烂茎线虫2-CysPrx与pET-41b融合蛋白。所述IPTG诱导培养条件为：温度18-37℃，IPTG浓度为0.2-1.4mmol/L。c、将候选化合物与重组DdPrx蛋白共孵育，根据硫氰酸铁法检测候选化合物是否对重组DdPrx蛋白具有较高离体抑制活性。所述共孵育是指将重组DdPrx蛋白加入含10μmol/L-40μmol/L候选化合物的反应缓冲液中，在30℃水浴条件下孵育30min，其中，该反应缓冲液为含10mmol/LDTT的1×PBS缓冲液，pH为7.0。依本专利技术提供的筛选方法获得的对重组DdPrx蛋白具有较高的抑制活性的化合物为1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉，经验证，该化合物具有抗植物线虫侵染的活性，能抵抗植物线虫的侵染，能用于制备抗植物线虫侵染药物。本专利技术还提供上述筛选方法在研发抗植物线虫侵染药物中的应用。本专利技术的离体筛选方法是基于硫氰酸铁法设计，其原理在于Prx蛋白能够催化H2O2转化为H2O和O2，剩余的H2O2则将Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+再与硫氰酸根离子形成的红色络合物在A475处有最大吸光值从而测定微量H2O2的变化量。而2-CysPrx抑制剂能明显降低重组DdPrx蛋白催化H2O2活性。用于2-CysPrx抑制剂的筛选，具有直接、简便、快速等优点，既可用于手工筛选，又可用于大规模高通量抑制剂的筛选。且本专利技术验证用的活体筛选方法是基于水稻根结线虫具有侵染水稻根这一特性设计，候选化合物若具有抗线虫侵染的活性，则水稻根结线虫侵染水稻根产生的根结与对照相比将明显减少。此方法不需染色即可用肉眼观察，便于实时跟踪候选化合物抗线虫侵染的活性变化。附图说明图1为DdPrx阅读框克隆及酶切鉴定电泳结果图。图中，M1：5000marker，1：PCR产物，2：pET-41b经XhoI单酶切，3：pET41b-DdPrx经XhoI单酶切，4：pET41b-DdPrx经NcoI单酶切，5：pET41b-DdPrx经XhoI和NcoI双酶切，M2：15000marker。图2为诱导IPTG浓度及温度对重组DdPrx蛋白表达量的影响。图中：M:即用型蛋白质分子量标准(低)；A为不同IPTG浓度的重组DdPrx蛋白表达量。其中，1：IPTG浓度为1.4mmol/L，2：IPTG浓度为1.0mmol/L，3：IPTG浓度为0.6mmol/L，4：IPTG浓度为0.2mmol/L，5：IPTG浓度为0mmol/L；B为18℃时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，1：有IPTG诱导的超声破菌的上清，2：有IPTG诱导的超声破菌的全菌液，3：无IPTG诱导的全菌液；C为25℃时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，1：有IPTG诱导的超声破菌的上清，2：有IPTG诱导的超声破菌的全菌液，3：无IPTG诱导的全菌液；D为37℃时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，1：无IPTG诱导的全菌液，2：有IPTG诱导的全菌液，3：有IPTG诱导的超声破菌的上清。图3为育有水稻幼苗的小烧杯放入装有适量湿润细沙的透明塑料箱中培养图。图4为不同浓度的1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉与药剂对照、丙酮对照根结生长趋势图。图中，药剂A为1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉，对照药剂B为2,3-双(溴甲基)喹啉。具体实施方式实施例1马铃薯腐烂茎线虫2-CysPrx基因的克隆根据GeneBank中马本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于以2‑Cys型过氧化物还原酶为靶点进行抗植物线虫侵染化合物筛选的重组表达质粒，该重组表达质粒为pET41b‑DdPrx。

【技术特征摘要】
1.重组表达质粒pET41b-DdPrx在以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点进行抗植物线虫侵染化合物筛选中的应用，抗植物线虫侵染化合物筛选包括如下步骤：a、构建含马铃薯腐烂茎线虫2-CysPrx基因的重组表达质粒pET41b-DdPrx；b、将重组表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，通过IPTG诱导培养以稳定表达重组DdPrx蛋白；c、将候选化合物与重组DdPrx蛋白共孵育，根据硫氰酸铁法检测候选化合物是否对重组DdPrx蛋白具有离体抑制活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁中，刘洋，刘建喜，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43