本发明专利技术提供了一种以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型，属于生物医药领域。该模型利用含有STAT3特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型STAT3的活性细胞为基础构建而成，用于筛选由STAT3组成型活化造成的癌变及肿瘤的治疗药物。由于采用具有组成型STAT3活性的细胞，模型细胞中报告基因处于高度活化状态，无需使用外加刺激物，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选，不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从“细胞培养→激活STAT3→加化合物→检测”简化为“细胞培养→加化合物→检测”，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升了系统的稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。
【技术实现步骤摘要】
以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型及其构建和应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有组成型STAT3活性细胞为基础的抗肿瘤药物筛选细胞模型；本专利技术同时还涉及该抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法和应用。
技术介绍
信号转导及转录激活因子3 (STAT3)作为重要的转录因子在癌症的发生和发展中发挥着重要的的作用，被公认为是癌症相关蛋白。在许多肿瘤细胞中，如结肠癌、乳腺癌、 神经胶质瘤细胞、肺癌、头颈部癌等等细胞中，STAT3常常以持续活化的形式存在，STAT3受到上游信号细胞因子刺激或在某些酪氨酸激酶持续活化的状态下，其C端705位酪氨酸被磷酸化而形成二聚体，进而入核调节转录，启动一系列基因的调控，在促进细胞转化、转移、 防止凋亡方面发挥多重作用。通常胞外调节STAT3的细胞因子的有IL-6，LIF, OSM, EGF, PDGF，G-CSF等，胞内维持STAT3持续活性的因素来自于上游受体或非受体酪氨酸激酶的持续活化或自身突变。研究表明，抑制STAT3活性将会大大降低多种肿瘤细胞的生长、生存和转移，从而大大降低它们恶性程度(Ni等人Cancer Res 2000 ； Leong等人Proc Natl Acad Sci 2003 ； Barton 等)κ Mol Cancer Ther 2004 ； Kortylewski 等)κ Nat Med 2005 ； Xin等人Cancer Res 2009)。此外研究表明，在不少肿瘤细胞中，STAT3可以促进和维持NF-κ B的活性，而NF-κ B则是肿瘤发生和转移的另一重要促成因素，在这一类肿瘤中抑制STAT3活性，不仅抑制了 STAT3本身调控的肿瘤相关基因，也在一定程度上下调NF- κ B 的活性，达到一点双靶的目的(Yang J等人Cancer Res 2005 ； Yang J等人Genes & Dev 2007 ； Torres J等人Nat Cell Biol 2008 ；Lee H等人Cancer Cell 2009 ；Yu H等人 Nat Rev Cancer 2009)。目前基于STAT3为靶点的药物筛选系统通常具有效率低下、步骤繁琐等缺点，例如每次筛药都需要使用外源细胞因子例如白细胞介素6 (IL-6)和白细胞抑制因子(LIF)激活细胞内STAT3，额外的步骤将使筛药系统的稳定性大大降低，成本也因IL-6或LIF的使用将大大增加。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型。本专利技术的另一目的是提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法。本专利技术还有一个目的，就是提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型在抗肿瘤药物筛选中的应用。(一)以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型本专利技术以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型，是利用含有STAT3特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型STAT3活性细胞为基础，构建成稳定的以STAT3信号为靶点高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型。所述STAT3的特异性结合序列为5’ -TT (C/A) CNNNAA-3，，N为碱基。所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有STAT3特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。所述具有组成型STAT3活性细胞为DU145前列腺癌细胞、H1299人肺癌细胞、AM9 人肺癌细胞、HCTl 19人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-468 人乳腺癌细胞或MDA-MB-231人乳腺癌细胞等等。(二)以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建。本专利技术以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型的构建，包括以下工艺步骤(1)报告系统载体构建利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有STAT3特异性结合序列以及3’端含有TATA盒序列的DNA片段， 作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当STAT3活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；抑制STAT3活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的水平都降低，也就抑制细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就减弱。(2)细胞模型的构建将报告系统载体转染具有组成型STAT3活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对已知STAT3信号抑制剂(如PD-180970，等已知特定细胞中 STAT3上游信号抑制剂)有响应的克隆，即为以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型。在具有组成型STAT3活性的细胞中，报告系统载体能很好地被活化，当使用STAT3 信号通路抑制剂时即可使荧光被显著抑制，构建的细胞模型也就无需在外源刺激下灵敏地用于高通量药物筛选。(三)以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型在抗肿瘤药物筛选中的应用。本专利技术以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型用于筛选由STAT3组成型活化造成的癌变及肿瘤的治疗药物。具体筛选抗肿瘤药物的方法包括以下工艺步骤(1)将所述抗肿瘤药物筛选细胞模型用100μ 1培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为30% 40% ；(2)在培养基中加入待筛选化合物0.1μ广2μl，继续培养 小时；(3)在上述96孔板中加入50μ 1稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；(4)以化合物细胞毒性实验消除化合物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率达仍在40% 以上得到复筛产物，即为以STAT3为靶点的抑制药物。本专利技术相对于现有技术具有以下优点以STAT3信号通路为靶点，采用基于具有组成型STAT3活性(即持续STAT3活性)的细胞系为策略，使报告系统本身在细胞中处于高度活化状态，得到的稳定细胞模型，无需使用外加刺激，可直接用于化合物的筛选；不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从“细胞培养一激活STAT3 —加化合物一检测”简化为“细胞培养一加化合物一检测”，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升了系统的稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。 附图说明图1为使用Western-Blot方法检测本专利技术所涉及的细胞中STAT3活性结果。图2为使用凝胶电泳阻抑试验(EMSA)检测本专利技术所涉及的细胞中STAT3活性结^ ο图3为所用报告载体基本骨架。图4为所构建的报告系统载体SIE-Iuc插入序列的测序结果图。图5为利用细胞检测报告系统载体SIE-Iuc响应能力。图6为使用Western-Blot方法检测A549细胞在已知抑制剂PD180970处理后的 STAT3活性变化。图7为抗肿瘤药物筛选细胞模型AM9R对STAT3活性降低或升高的响应。图8为使用Western-Blot方法检测所筛的化合物3412对STAT3活化的抑制能力。具体实施方式下面以A549细胞为例，本专利技术抗肿瘤药物筛选细胞模型的结构、构建方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈星，杨金波，杜宇平，王勤，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：
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