一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取人肿瘤细胞细胞膜蛋白的方法，包括细胞的破碎、差速离心分离细胞膜、膜蛋白的溶解以及膜蛋白纯度的Western Blot检测。本发明专利技术主要是针对人肿瘤细胞膜蛋白的提取，为肿瘤细胞膜蛋白组学研究提供新的方法。此发明专利技术将有助于进一步进行关于抗肿瘤药物致人肿瘤细胞膜蛋白表达水平影响的机制研究，为抗肿瘤药物靶点的筛选及相关研究提供有用的技术手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制品领域，具体的说是提供一种人肿瘤细胞膜蛋白的提取方法。技术背景细胞膜是细胞对外界的屏障和细胞内外环境交流的界面，它使细胞与周边环境隔离，维持着相对稳定的细胞内环境。膜蛋白是细胞膜的重要组成部分，执行着细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号转导和调控，以及能量传递等重要功能。在基因组中，编码膜蛋白的基因约占基因总数的三分之一。在已知的药物靶标中，大约有70％是膜蛋白，包括G蛋白偶联受体，离子通道蛋白，转运蛋白，细胞色素P450等。关于膜蛋白的动态观察和表征对深入理解生理过程，疾病机制和药物靶点的筛选具有十分重大的意义。膜蛋白的异常表达和修饰与肿瘤细胞的恶性行为密切相关。信号受体如离子通道偶联受体、G蛋白偶联受体、酪氨酸激酶受体等的异常可以激活或启动一系列生物化学反应，在肿瘤的发生、发展和转移过程具有关键作用。膜转运蛋白如载体蛋白发现与肿瘤的抗药性有非常密切的关系。细胞黏附蛋白作为一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互作用的蛋白，在肿瘤转移过程发挥重要作用。由上可见，肿瘤细胞中膜蛋白的研究对探索肿瘤细胞的形成机制，筛选肿瘤标志物和药物靶点都是非常重要的。对于肿瘤细胞膜蛋白的研究，膜蛋白的分离纯化是研究的基础和起点。由于大多数膜蛋白是低丰度蛋白、具有很强的疏水性，这些特点给膜蛋白的提取纯化带来了挑战。当前膜蛋白的提取方法通常使用表面活性剂、超声波破碎、蔗糖梯度密度离心、差速梯度离心、生物素化等方法。在膜蛋白的研究过程中，表面活性剂对膜蛋白的提取、纯化以及稳定膜蛋白的生物活性具有非常重要的作用。目前，研究膜蛋白的表面活性剂有SDS、Triton X-100、NP-40、OG、CHAPS等等。然而，这些表面活性剂由于自身的特点，在膜蛋白质组学的具体应用中具有各自的局限性，如对膜蛋白增溶性不好，不能有效稳定膜蛋白的生物活性，或者不兼容后续的酶解和质谱鉴定等。对称型表面活性剂(Gemini surfactant)是一类具有对称结构的二聚型双亲分子。近年来，在膜蛋白体系的研究中崭露头角。为膜蛋白科学的研究提供新型的分子工具。
技术实现思路
针对现有技术的缺乏和不足之处，本专利技术提供一种人肿瘤细胞膜蛋白的提取方法。本专利技术通过以下方案实现：一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法，按照以下步骤进行：1.对所收集的人肿瘤细胞使用10mmol/L Tris-HCl溶液中，于冰上使用Dounce匀浆器匀浆；2.匀浆液在4℃以4000rpm的离心后收集上清液，沉淀为未破碎细胞及细胞核；3.细胞上清液在4℃以14400rpm离心后收集上清液，沉淀为线粒体；4.细胞上清液在4℃以35300rpm离心后收集沉淀，上清液为细胞浆溶液；5.沉淀用膜蛋白裂解液于冰上裂解；使用的膜蛋白裂解液组成有效成分为7mmol/L尿素，2mmol/L硫脲，4％对称型表面活性剂化合物，40mmol/L DTT；6.经过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜超滤处理后，分装。步骤(1)中使用Dounce匀浆器的细胞破碎方法。步骤(4)中使用离心条件为35300rpm离心60分钟。步骤(6)中使用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜。步骤(5)中的对称型表面活性剂的结构为：或有益效果1、采用Dounce匀浆器冰上对人肿瘤细胞进行破碎，其收集膜蛋白组分的纯度要远远高于超声波破碎，主要原因是由于采用差速离心分离不同的细胞器，其原理是通过不同细胞器自身的密度差异进行分离纯化，匀浆器通过机械方法破碎细胞，能够较好地保存各种细胞器的完整性，可以通过差速离心纯化密度不同的细胞，达到良好的分离效果。而超声波破碎是通过高频的交变水压强，使空气膨胀爆炸，将细胞击碎。这种破碎方式不仅彻底破碎细胞，也将亚细胞器打碎，达不到良好的亚细胞器分离效果，为膜蛋白组分带来其他细胞器的杂质。2、膜蛋白裂解液采加入对称型表面活性剂化合物1和2，其溶解膜蛋白的效果要明显优于其他商品化表面活性剂，如OG、DDM和CHAPS。与传统的表面活性剂相比，对称型表面活性剂具有更高的表面活性和更为优良的物理化学性质，如超低界面张力、低临界胶束浓度、Krafft点等。其中，低临界胶束浓度的特点让对称型表面活性剂在水溶液中非常容易聚集形成胶束，对膜蛋白具有更强的增溶作用，从而提高溶解膜蛋白的效率。3、通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜超滤蛋白样品，能有效浓缩蛋白以提高蛋白浓度，满足后续蛋白质组学研究的要求。4、本方法采用冰上匀浆和对称型表面活性剂化合物1和2配制的膜蛋白裂解液提取人肿瘤细胞膜蛋白，具有细胞膜蛋白产率高和纯度高的优点。附图说明图1：不同细胞器标志蛋白在匀浆破碎和超声波破碎中膜蛋白组分的含量。具体实施方式下面结合附图和实例对本专利技术做进一步的描述。一种人肿瘤细胞膜蛋白的提取方法，包括以下步骤：(1)对所收集的人肿瘤细胞使用10mmol/L Tris-HCl溶液中，于冰上使用Dounce匀浆器匀浆60分钟；(2)匀浆液在4℃以4000rpm的离心15分钟，收集上清，沉淀为未破碎细胞及细胞核等细胞器；(3)细胞上清液在4℃以14400rpm离心30分钟，收集上清，沉淀为线粒体等细胞器；(4)细胞上清在4℃以35300rpm离心60分钟，收集沉淀，上清为胞浆等溶液；(5)沉淀用膜蛋白裂解液(7mmol/L尿素，2mmol/L硫脲，4％对称型表面活性剂化合物1，40mmol/L DTT)于冰上裂解30分钟；(6)经过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜超滤处理后，分装。1、材料实验所选用为人宫颈癌细胞系(HeLa)，细胞在10％胎牛血清的MEM培养基中培养。2、方法2.1细胞培养及收集取长满单层的人宫颈癌细胞(约1×107)，弃去原培养基，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗2次，用细胞刮将细胞收集到离心管中，4000rpm离心5分钟，弃去上清，加入1毫升10mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)溶液，反复吹打成细胞悬浮液。2.2破碎细胞及膜蛋白的分离纯化在细胞膜的分离纯化过程中，细胞的破碎方式选择非常关键，直接影响到最后膜蛋白组分的纯度。本专利技术比较了两种不同的细胞破碎方式，分别是超声波破碎和匀浆破碎，并在最终对两种方法提取的膜蛋白进行Western blot检测，比较两种细胞破碎方式的膜蛋白分离效果。匀浆破碎的将细胞悬浮液转移至Dounce匀浆器(7毫升)中，在冰上匀浆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)对所收集的人肿瘤细胞使用10mmol/L Tris‑HCl溶液中，于冰上使用Dounce匀浆器匀浆；(2)匀浆液在4℃以4000rpm的离心后收集上清液，沉淀为未破碎细胞及细胞核；(3)细胞上清液在4℃以14400rpm离心后收集上清液，沉淀为线粒体；(4)细胞上清液在4℃以35300rpm离心后收集沉淀，上清液为细胞浆溶液；(5)沉淀用膜蛋白裂解液于冰上裂解；使用的膜蛋白裂解液组成有效成分为7mmol/L尿素，2mmol/L硫脲，4％对称型表面活性剂化合物，40mmol/L DTT；(6)经过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜超滤处理后，分装。

【技术特征摘要】
1.一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
(1)对所收集的人肿瘤细胞使用10mmol/L Tris-HCl溶液中，于冰上使用Dounce
匀浆器匀浆；
(2)匀浆液在4℃以4000rpm的离心后收集上清液，沉淀为未破碎细胞及细胞核；
(3)细胞上清液在4℃以14400rpm离心后收集上清液，沉淀为线粒体；
(4)细胞上清液在4℃以35300rpm离心后收集沉淀，上清液为细胞浆溶液；
(5)沉淀用膜蛋白裂解液于冰上裂解；使用的膜蛋白裂解液组成有效成分为7
mmol/L尿素，2mmol/L硫脲，4％对称型表面活性剂化合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪文旭，欧阳建平，邓晰月，曾序春，段山，
申请(专利权)人：深圳市人口和计划生育科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44