从精浆中提取胞外ＲＮＡ的方法技术

本发明专利技术提供了一种从精浆中提取胞外ＲＮＡ的方法，包括将收集和分离精浆、对精浆进行两次变性液处理、用异丙醇和乙醇沉淀和洗涤ＲＮＡ等步骤，该方法结合精液的生物化学特点和胞外ＲＮＡ的特点，有针对性地选择和组合ＲＮＡ提取试剂，针对精浆中含丰富的蛋白质，在变性液中加入了Ｎ－十二烷基肌氨酸钠，以促进硫氰酸胍对蛋白质的变性作用；针对胞外ＲＮＡ一般与某种物质结合的特点，在变性液中加入了Ｔｒｉｔｏｎ？Ｘ－１００，有利于ＲＮＡ与所结合物质的分离。该方法成本低廉、结果可靠、易于推广应用，所提取的胞外ＲＮＡ含量高、质量好，为一种无创性的手段，可替代现行的穿刺方法而应用于男性生殖器官基因表达研究和器官功能检测、评定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及RNA的提取方法，尤其涉及从精浆中提取游离RNA的方法。
技术介绍
胞外RNA是存在于细胞外的RNA，近年来被认为在基因表达研究、疾病诊断、法医鉴定等方面有很好的应用前景[参见：Vlassov VV，Laktionov PP，RykovaEY.Extracellular nucleic acids.Bioessays 2007，29：654-67]。精液是生殖系统多个器官共同分泌和排除液体的混合物，是进行生殖系统疾病诊断的重要标本[参见：熊承良，主编.《临床生殖医学》.人民卫生出版社.2007.p23-8]。目前，研究和检测男性生殖系统器官(如睾丸、前列腺、精囊腺等)的某些基因的表达，及临床诊断某些男性生殖系统疾病，如肿瘤、睾丸精子发生情况，都依赖于穿刺，穿刺的有创性和不易接受性，在很大程度上限制了对生殖系统器官基因表达分析的研究和应用。胞外RNA是指存在于细胞膜外的RNA，一般认为来源于细胞死亡后释放或活细胞分泌至胞外(图2)[参见：Fleischhacker M，Schmidt B.Circulatingnucleic acids(CNAs)and cancer-A survey.Biochim Biophys Acta 2007.1775：181-232]，并可能与其他物质结合[参见：Park NJ，Li Y，Yu TW，BrinkmanBM，Wong DT.Characterization of RNA in saliva.Clin Chem 2006.52：988-94]，增加其稳定性[参见：Zubakov D，Hanekamp E，Kokshoorn M，etal.Stable RNA markers for identification of blood and saliva stainsrevealed from whole genome expression analysis of time-wise degradedsamples.Int J Legal Med 2008，122：135-42]，逃脱RNA酶的降解作用。国外对胞外RNA的研究开始于1999年，两个小组在肿瘤患者外周血血浆中检测肿瘤来源的RNA[参见：Lo KW，Lo YMD，Leung SF，et al.Analysis of cell-freeEpstein-Barr virus associated RNA in the plasma of patients withnasopharyngeal carcinoma.Clin Chem 1999，45：1292-4；Kopreski MS，BenkoFA，Kwak LW，et al.Detection of tumor messenger RNA in the serum ofpatients with malignant melanoma.Clin Cancer Res 1999，5：1961-5]。目前，对于胞外RNA的研究成为一个新的热点，除外周血血浆外，已在唾液、支气管灌洗液、尿液中发现有胞外RNA的存在[参见：Li Y，Zhou X，John S，etal.RNA profiling of cell-free saliva using microarray technology.J DentRes 2004，83：199-203；Schmidt B，Carstensen T，Engel E，et al.Detectionof cell-free nucleic acids in bronchial lavage fluid supernatants frompatients with lung cancer.Eur J Cancer 2004，40：452-60]，其中以血浆和唾液中胞外RNA研究相对较多。由于胞外RNA对其来源器官基因表达的全面代表性，分子生物学技术的快速、敏感而准确，及其快速发展趋势和前景，胞外RNA被认为在疾病诊断、法医鉴定、产前诊断等方面有很好的应用价值[参见：Vlassov VV，Laktionov PP，Rykova EY.Extracellular nucleic acids.Bioessays 2007，-->29：654-67]。虽然目前已有一些关于胞外RNA的研究，但却缺少一种廉价而可靠的提取这些胞外RNA的方法，目前所用的方法主要是用昂贵的试剂盒，如联合应用TRIzol LS和QIAGEN RNasy Kit来提取胞外RNA。目前也未见精浆胞外RNA的研究。
技术实现思路
本专利技术的任务是提供一种从精浆中提取游离RNA的方法，使其具有价廉、安全可靠、容易操作、易于推广应用、所提取的胞外RNA含量高、质量好、无创等特点，可替代现行的穿刺方法，从而克服现有技术的不足。实现本专利技术的技术方案是：本专利技术提供的这种从精浆中提取胞外RNA的方法包括以下步骤：(1)配制变性液A：变性液A由pH值和浓度分别为7.0和50mmol/L的柠檬酸钠.2H2O、8mol/L的硫氰酸胍、1％的N-十二烷基肌氨酸钠、2％的TritonX-100组成，在临用前，按每毫升变性液A加入14.4mol/L的β-巯基乙醇14ul；(2)取1ml高速离心后精浆，置5ml离心管中，加入等体积变性液A，用吸头吹打混匀；(3)依次加入pH和浓度分别为4.0和2mol/L的醋酸钠0.2ml、苯酚2ml和按氯仿与异戊醇体积比为49∶1的比例混合的氯仿与异戊醇混合液0.4ml，每加一种后倒置混匀，全部加完后剧烈振荡30秒；(4)冰浴15分钟；(5)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；(6)小心吸取上清入另一离心管中，向该上清离心管中加入与上清等体积的预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；(7)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；(8)配制变性液B：变性液B由pH和浓度分别为5.2和300mmol/L的乙酸钠浓度、浓度为4mol/L的硫氰酸胍组成；(9)弃上清，收集沉淀，加入0.5ml变性液B溶解沉淀，沉淀溶解后移入1.5ml离心管中；(10)加入0.5ml预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；(11)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；(12)弃上清，向沉淀中加入用不含RNA酶的水配制的75％乙醇1ml，用吸头吹打使沉淀溶解；(13)在离心力为12000g和4℃条件下离心5分钟；(14)弃上清，干燥5分钟，向沉淀中加入50μl不含RNA酶的水溶解沉淀，即为所提取的精浆胞外RNA。本专利技术在研究精子mRNA工作中，发现精浆中有胞外RNA，建立了从精浆中提取胞外RNA的方法，这种方法结合精液的生物化学特点和胞外RNA的特点，有针对性地选择和组合RNA提取试剂，主要有：①精浆中含丰富的蛋白质，在变性液A中加入N-十二烷基肌氨酸钠，促进硫氰酸胍对蛋白质的变性作用；且在获得RNA沉淀后，再用变性液B处理一次。②胞-->外RNA一般与某种物质结合[参见：Vlassov VV，Laktionov PP，Rykova EY.Extracellular nucle本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从精浆中提取胞外ＲＮＡ的方法，包括以下步骤：　　（１）配制组份及终浓度如下的变性液Ａ：　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠．２Ｈ↓［２］Ｏ（ｐＨ　７．０）　　８ｍｏｌ／Ｌ硫氰酸胍　　１％Ｎ－十二烷基肌氨酸钠（ｓａｒｃｏｓｙｌ）　　２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１０００．　　２ｍｏｌ／Ｌ　β－巯基乙醇（临用前加，每ｍｌ加１４．４ｍｏｌ／Ｌβ－巯基乙醇１４ｕｌ）　　在临用前，按每毫升变性液Ａ加入１４．４ｍｏｌ／Ｌ的β－巯基乙醇１４ｕｌ；　　（２）取１ｍｌ高速离心后精浆，置５ｍｌ离心管中，加入等体积变性液Ａ，用吸头吹打混匀；　　（３）依次加入ｐＨ和浓度分别为４．０和２ｍｏｌ／Ｌ的醋酸钠０．２ｍｌ、苯酚２ｍｌ和按氯仿与异戊醇体积比为４９∶１的比例混合的氯仿与异戊醇混合液０．４ｍｌ，每加一种后倒置混匀，全部加完后剧烈振荡３０秒；　　（４）冰浴１５分钟；　　（５）在离心力为１２０００ｇ和４℃条件下离心１５分钟；　　（６）小心吸取上清入另一离心管中，向该上清离心管中加入与上清等体积的预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置－２０℃沉淀１小时；　　（７）在离心力为１２０００ｇ和４℃条件下离心１５分钟；　　（８）配制组份及终浓度如下的变性液Ｂ：　　３００ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸钠（ｐＨ　５．２）　　４ｍｏｌ／Ｌ硫氰酸胍　　（９）弃上清，收集沉淀，加入０．５ｍｌ变性液Ｂ溶解沉淀，沉淀溶解后移入１．５ｍｌ离心管中；（１０）加入０．５ｍｌ预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置－２０℃沉淀１小时；　　（１１）在离心力为１２０００ｇ和４℃条件下离心１５分钟；　　（１２）弃上清，向沉淀中加入用不含ＲＮＡ酶的水配制的７５％乙醇１ｍｌ，用吸头吹打使沉淀溶解；（１３）在离心力为１２０００ｇ和４℃条件下离心５分钟；　　（１４）弃上清，干燥５分钟，向沉淀中加入５０μｌ不含ＲＮＡ酶的水溶解沉淀，即为所提取的精浆胞外ＲＮＡ。...

【技术特征摘要】
1.一种从精浆中提取胞外RNA的方法，包括以下步骤：(1)配制组份及终浓度如下的变性液A：50mmol/L柠檬酸钠.2H2O(pH 7.0)8mol/L硫氰酸胍1％N-十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)2％(v/v)Triton X-1000.2mol/L β-巯基乙醇(临用前加，每ml加14.4mol/Lβ-巯基乙醇14ul)在临用前，按每毫升变性液A加入14.4mol/L的β-巯基乙醇14ul；(2)取1ml高速离心后精浆，置5ml离心管中，加入等体积变性液A，用吸头吹打混匀；(3)依次加入pH和浓度分别为4.0和2mol/L的醋酸钠0.2ml、苯酚2ml和按氯仿与异戊醇体积比为49∶1的比例混合的氯仿与异戊醇混合液0.4ml，每加一种后倒置混匀，全部加完后剧烈振荡30秒；(4)冰浴15分钟；(5)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；(6)小心吸取上清入另一离心管中，向该上清离心管中加入与上清等体积的预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；(7)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；(8)配制组份及终浓度如下的变性液B：3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红钢，熊承良，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]