一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法技术

本发明专利技术提供的一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，针对绵羊皮肤组织结构的复杂性，采用冷冻破碎法粉碎组织，然后摸索出适合绵羊皮肤组织的超声破碎条件，并通过涡旋使样品裂解更充分，以便能提高皮肤组织的利用率，尽可能少地破坏蛋白内的分子结构，产出高质量的蛋白。该方法操作简单可靠，方便快捷，成本低廉，为体内皮肤组织蛋白提取提供了成熟的高效的技术方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及绵羊皮肤组织蛋白提取的方法，可用于蛋白的Western blot杂交检测，也可用于二维凝胶电泳(2-DE)分离，以及利用皮肤组织制备生物活性的蛋白质。
技术介绍
绵羊皮肤组织致密，结构完善，有着重要的保护作用。绵羊皮肤由表皮和真皮组成，表皮有许多衍生物，如各种腺体、毛、角、爪、甲、蹄；真皮发达，由胶原纤维及弹性纤维的结缔组织构成，两种纤维交错排列，其间分布有各种结缔组织细胞、感受器官、运动神经末梢及血管、淋巴等；相对于其它组织来说，绵羊皮肤组织结构更为复杂，皮肤组织蛋白的提取也较其它组织难度大；获得对于研究绵羊组织器官功能、生物活性蛋白制备具有重要意义。据文献检索披露:①2010年徐小燕、夏蒲，邢亚楠等在《中国医科大学学报》2010，39(5):336-339.发表的文章“冻结破碎法提取组织蛋白方法初探”揭示了冻结破碎法和匀浆法提取小鼠组织蛋白后进行蛋白定量，然后用Western blot检测内参β-actin蛋白的表达，结果表明两种方法提取的总蛋白浓度以及β-actin蛋白表达无明显统计学差异。②2009年王簕、裴国献等在《生命科学研究》2009，13 (2): 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，其特征在于：分前处理、冷冻破碎、冰浴超声、蛋白定量及SDS?PAGE、Western?blot的检测步骤：步骤1.将冰浴皮肤组织样品拔毛处理，用预冷的1×PBS洗涤3次，吸干液体；称取25?30mg样品，置于预冷的2ml离心管中，将其剪碎至0.8?1mm3的小块，置于?70℃冰箱中；步骤2.取上步样品，加入直径为5?7cm无菌钢珠，置于TissueLyser??LT仪器中粉碎，其频率50Hz，工作2?5min；破碎后，取出钢珠，加入预冷的蛋白酶抑制剂的裂解液，其加量为每100mg湿重组织加200?300μl，置于冰浴中超声破碎，其功率200W，工作10S，间...

【技术特征摘要】
1.一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，其特征在于:分前处理、冷冻破碎、冰浴超声、蛋白定量及SDS-PAGE、Western-blot的检测步骤: 步骤1.将冰浴皮肤组织样品拔毛处理，用预冷的IXPBS洗涤3次，吸干液体；称取25-30mg样品，置于预冷的2ml离心管中，将其剪碎至0.8-lmm3的小块，置于_70°C冰箱中；步骤2.取上步样品，加入直径为5-7cm无菌钢珠，置于TissueLyser LT仪器中粉碎，其频率50Hz，工作2-5min ;破碎后，取出钢珠，加入预冷的蛋白酶抑制剂的裂解液，其加量为每IOOmg湿重组织加200-300μ1，置于冰浴中超声破碎，其功率200W，工作10S，间隙15S, 25次，且避免大量泡沫产生； 步骤3.将超声后的样品置于漩涡混合器上涡旋30-40S，4°C、采用13000转/分钟、离心25-30分钟；提取上清液，置于_70°C冰箱中，用BCA法测定其蛋白浓度；取IOOPg蛋白样品加入等量的2X loading buffer混合均勻,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白； 步骤4.采用Western blotting免疫印迹检测蛋白的表达，即操作:将凝胶放入电转缓冲液中，湿转法100V转印60 min后，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用一抗鼠抗HA单抗I: 400稀释，同时以β-act in...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雪梅，李文蓉，贺三刚，张宁，刘明军，
申请(专利权)人：新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心，
类型：发明
国别省市：