一种ACAP4活性抑制蛋白的鉴定及其在细胞迁移中的作用制造技术

本发明专利技术公开了一种ACAP4活性抑制蛋白的鉴定及其在细胞迁移中的作用。其目的是提供一种ACAP4活性抑制蛋白及其编码基因与其在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。该蛋白是下述氨基酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO.1；2)将序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对ACAP4和ARF6活性具有调节作用的蛋白质。该蛋白是ACAP4活性抑制蛋白，它可以通过调节和ACAP4结合能力及其底物ARF6的活性来发挥信号通路的作用，调控肿瘤细胞的迁移功能。因此，可以其为药物靶标进行小分子化合物的筛选，发掘可能抑制肿瘤细胞转移的药物，本发明专利技术的蛋白及其编码基因有可能将在医学及制药领域发挥重要作用，前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及ACAP4活性抑制蛋白及其编码基因与其在肿瘤细胞迁移中的作用。 
技术介绍
ACAP4是中国科学技术大学细胞动力学实验室利用ARF6显性激活型突变体和HeLa细胞裂解液孵育，通过质谱鉴定和生化实验的方法发现的(Fang et al.,2006)，该蛋白具有GTP酶激活蛋白水解活性(专利授权号：ZL200610007868.X，专利名称：一个ARF6激活蛋白及其编码基因与应用)。现在越来越多的证据表明ACAP4参与调控表皮生长因子(EGF)介导的下游信号通路，并在相关恶性肿瘤的发生和发展中有着重要的功能(Yu et al.,2011；Zhao et al.,2013)。ARF6在生命活动中发挥着很重要的作用，具有GTP结合的活性形式和GDP结合的失活形式。ACAP4作为ARF6特异性的GTP酶激活蛋白，可以使ARF6-GTP结合状态水解为ARF6-GDP形式(Ismail et al.,2010)。在对乳腺癌相关的肿瘤细胞研究发现，具有活性的ARF6显著促进了肿瘤细胞的转移和浸染能力(Sabe et al.,2009)。由于ARF6在肿瘤细胞转移过程中非常关键的作用，因此对其活性的调节机制的研究成为众多科学家们关注的重中之重。目前，已经发现细胞中有多种蛋白有效调节ARF6活性(Inoue and Randazzo,2007)，但是对于ACAP4如何在时空上动态的调节ARF6的活性的研究现在仍不完善，所以寻找调节ACAP4功能的相关蛋白是一项具有重要意义的工作。 
技术实现思路
r>本专利技术的主要内容是发现了一个新的ACAP4活性抑制蛋白，并对其调节ACAP4的GAP活性等生化特征和在肿瘤细胞转移中的作用进行了系统的鉴定。 因此，本专利技术的第一个方面提供ACAP4特异性活性抑制蛋白，将其命名为Acapin,原用名为ARRDC5(Arrestin Domain Containing 5或Arrestin Domain-Containing Protein 5)，所述ACAP4特异性活性抑制蛋白的基因(cDNA)来源于商品化的基因文库，经过PCR获得，所述ACAP4特异性活性抑制蛋白具有下述氨基酸序列之一： 1)序列表中的SEQ ID NO.1； 2)将序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与ACAP4蛋白结合对ARF6活性具有调控功能的蛋白质。 序列表中的SEQ ID NO.1由342个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第27-138位氨基酸残基具有一个N-terminal Arrestin domain结构域，另外其羧基端(C端)第184-318位氨基酸还包括一个C-terminal Arrestin domain结构域。 所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。 本专利技术的第二个方面提供上述Acapin蛋白的编码基因acapin，所述基因acapin具有下述核苷酸序列之一： 1)序列表中SEQ ID NO.2的DNA序列； 2)编码序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸序列的DNA序列； 3)与序列表中SEQ ID NO.2限定的DNA序列或2)中所述编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列的DNA序列具有90％以上同源性且表达产物与ACAP4蛋白结合对ARF6活性具有调控功能的核苷酸序列； 4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.2限定的DNA序列或2)中所述编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列的DNA序列杂交的核苷酸序列。 所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。 序列表中的SEQ ID NO.2由1029个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1029位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列的蛋白质。 本专利技术的第三个方面提供含有本专利技术第二个方面所述编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。 本专利技术的第四个方面提供扩增本专利技术第二个方面所述编码基因acapin中任一片段的引物对。 本专利技术的第五个方面提供本专利技术第一个方面所述的ACAP4特异性活性抑制蛋白的抗体。 在一个优选的实施方案中，所述抗体靶向Acapin1-179结构域。 本专利技术的第六个方面提供上述蛋白、其编码基因、含有上述蛋白编码基因的载体在制备抑制肿瘤细胞转移、治疗癌症的药物中的用途。 在一个优选的实施方案中，所述癌症为乳腺癌。 本专利技术的第七个方面提供Acapin特异性的siRNA，及所述siRNA在制备用于抑制细胞迁移的药物中的用途。 综上，本专利技术提供了一个ACAP4GAP活性的特异性的抑制蛋白Acapin，它由342氨基酸组成，在细胞内具有广泛分布，参与ACAP4活性的功能调控。Acapin与ARF6竞争性结合ACAP4的GAP功能结构域，直接抑制ACAP4的GAP水解活性，从而上调了细胞内ARF6活性，最终影响乳腺癌细胞的迁移速度。当正常细胞或恶性肿瘤细胞受到外界环境中某些细胞因子(如表皮生长因子EGF等)刺激时，Acapin会发生翻译后修饰，从而增强其与ACAP4的GAP功能结构域的结合能力，达到调控其活性的目的。当利用Acapin特异性的siRNA敲低Acapin在细胞内表达水平，能够显著抑制细胞迁移能力。因此我们可以得出结论，Acapin是ACAP4活性的特异性抑制蛋白，它可以通过调控ACAP4及其底物ARF6的活性来发挥信号通路的作用，最终调控肿瘤细胞的转移能力。因此，可以其为药物靶标进行小分子化合物的筛选，发掘可能抑制肿瘤细胞转移的药物，本专利技术的蛋白及其编码基因有可能在医学及制药领域发挥重要功能，前景广阔。 下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。 附图说明图1为ACAP4活性抑制蛋白Acapin的发现及其结构域分析。 A.酵母双杂交实验结果显示，ACAP4和Acapin在酵母细胞中存在相互作用，其中在酵母细胞中共转BD-p53和AD-T抗原为阳性对照，共转BD-lam和AD-T抗原为阴性对照； B.对Acapin进行生物信息学分析，显示其具有N-terminal Arrestin domain(NAD)和C-terminal Arrestin domain(CAD)功能结构域。 图2为体内和体外生化实验验证ACAP4和Acapin发生相互作用。 A.Acapin和ACAP4在体内形成复合物，HEK293T细胞中共转FLAG-Acapin和HA-ACAP4，24小时后利用FLAG M2树脂进行免疫共沉淀实验； B.体外生化实验验证GST-Acapin和Duet-ACAP4的相互作用，偶联在谷胱甘肽树脂上的GST-Acapin与纯化的Duet-ACAP4孵育，GST作为阴性对照，进行Pull down实验，结果表本文档来自技高网...

【技术保护点】
ACAP4活性抑制蛋白Acapin，其氨基酸序列为以下之一：1)序列表中的SEQ ID NO.1；2)将序列表中SEQ ID NO.1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.1的序列同样功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.ACAP4活性抑制蛋白Acapin，其氨基酸序列为以下之一：
1)序列表中的SEQ ID NO.1；
2)将序列表中SEQ ID NO.1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残
基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.1的序列同样功能的蛋白质。
2.权利要求1所述的ACAP4活性抑制蛋白Acapin的编码基因。
3.根据权利要求2所述编码基因：所述基因的核苷酸序列为以下之一：
1)序列表中SEQ ID NO.2的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸序列的DNA序列；
3)与序列表中SEQ ID NO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性
且表达产物具有与SEQ ID NO.1的序列同样功能的核苷酸序列；
4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.2限定的DNA序列杂交
的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
5.权利要求2或3所述的ACAP4活性抑制蛋白编码基因acapin...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚雪彪，周佳佳，王峰松，赵玄女，王冬梅，丁霞，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34