一种以HIF为靶点的抗肿瘤药物筛选的方法及其应用技术

一种以ＨＩＦ为靶点的抗肿瘤药物筛选方法及应用，属抗肿瘤药物筛选的技术领域。本发明专利技术的技术方案是构建稳定表达ＨＲＥ和Ｌｕｃ的转染细胞株，通过检测Ｌｕｃ的活性，确定待筛选化合物对ＨＩＦ的作用，实现对抗肿瘤药物的筛选。用上述方法的工作原理，可制成快速筛选以ＨＩＦ为靶点的抗肿瘤药物的试剂盒。本发明专利技术具有自动化程度高、快速、高效、简便、直观且省药品等优点，适合应用于高通量快速筛选以ＨＩＦ为靶点的抗肿瘤药物，特别适用于可供筛选的物质种类多，但含量少时的情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种以HIF为靶点的抗肿瘤药物筛选的方法及其应用，确切地说，涉及一种以低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)为靶点的抗肿瘤血管生成药物筛选的方法及其应用，属抗肿瘤药物筛选的

技术介绍
肿瘤血管(Angio)指围绕着肿瘤而新生的血管。Angio使肿瘤获得继续生长的氧气和养分供应，是肿瘤增殖和生存的重要条件。从某种意义上说，Angio使肿瘤能利用患者自身来摧毁患者。Angio是一种受多因素、多机制调控的现象。HIF在其中起着极其重要的作用。当对肿瘤的供氧不足时，肿瘤便会产生HIF，而HIF进而促使正常血管长出帮助肿瘤生长的分支血管。见图1。常见的发生Angio的肿瘤包括结肠癌、肾癌、肝癌和乳腺癌等实体瘤。研究发现，上述肿瘤细胞表现为HIF高表达。其它类型的肿瘤增殖中也常伴有HIF表达的上调。HIF是一种转录蛋白，不具有可直接的检测的活性。它只有与其结合位点(hypoxia responsive element，HRE)结合后，促使其它基因，例如磷光酶(Luciferase，Luc)的表达，从而来体现它的存在。见图2。因此，Luc的活性高低也就反映了HIF表达的高低。HIF发现于1992年。数年后，人们才发现HIF与肿瘤的密切关系。2001年以来，HIF的调控机制才被逐步搞清。目前国外刚刚开始致力于探寻临床有效的HIF抑制剂，而且还没有建立标准化的有效的筛选方法，至今也没有发现特异的抑制剂。国内在这方面的工作则是空白。由于缺乏标准化的、有效的筛选方法，极大地限制了HIF抑制剂的筛选和应用。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种以HIF为靶点的抗肿瘤药物筛选的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是构建稳定表达HRE和Luc的转染细胞株，通过检测Luc的活性，确定待筛选化合物对HIF的作用，实现对抗肿瘤药物的筛选。现详细说明本专利技术的技术方案。一种以HIF为靶点的抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤第一步 构建稳定表达HRE和Luc的转染细胞株①构建含人HRE和Luc基因的重组质粒；②转染人肿瘤细胞株，获得稳定表达HRE和Luc的转染细胞株；第二步 建立合适的磷光检测系统；第三步 建立合适的低氧条件，在该条件时，转染细胞株的Luc活性增强；第四步 进行以HIF为靶点的抗肿瘤药物筛选用待筛选化合物作用转染细胞，在合适的低氧条件下孵育一定时间，检测Luc活性，如果待筛选化合物使细胞内的Luc活性减弱，说明该化合物可能是一种HIF的抑制剂，具有抗肿瘤血管生成的作用，因此是一种抗肿瘤药物。本专利技术的第二个目的是提供上述方法的一种应用，确切地说，推出一种以上述方法工作的快速筛选以HIF为靶点的抗肿瘤药物的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种以上述方法工作的快速筛选以HIF为靶点的抗肿瘤药物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒内装有转染细胞株、Luc底物、磷光检测试剂、阳性对照药品，即经典的HIF抑制剂、阴性对照药品、细胞裂解液等。与
技术介绍
相比，本专利技术具有自动化程度高、快速、高效、简便、直观且省药品等优点，适合应用于高通量快速筛选以HIF为靶点的抗肿瘤药物，特别适用于可供筛选的物质种类多，但含量少时的情况。附图说明图1示出了肿瘤血管的发生。当肿瘤在氧气供给发生短缺(Hyp)时便产生HIF。然后HIF促使血管朝向肿瘤生长，从而保证了对肿瘤的氧气和养分供应，使肿瘤得以继续发育和生长。图2是HIF表达的检测原理。缺氧条件(Hyp)促使了细胞内HIF的高表达，与HRE结合的HIF的量随之增加，从而使得产生的Luc的量也增加。图3是HRE的序列。HRE由PCR合成。深色标记的部分指示的分别是KpnI(51)和XhoI(31)的酶切位点。图4是HepGHRE细胞株的选择。此克隆在缺氧条件(5％O2，16小时)下与正常氧(Nor)条件下相比，LucHyp∶LucNor比率达到了11.5。图5是缺氧持续时间对HIF表达的影响。HepGHRE细胞在含氧量为5％的缺氧条件下处理0-32小时，然后测定Luc的活性。图6是缺氧持续时间对HIF表达的影响。HepGHRE细胞在21％-0％含氧量的缺氧条件下处理16小时，然后测定Luc的活性。图7是阳性药物LY294002对HIF表达的影响。HepGHRE细胞在21％或1％含氧量的条件下分别孵育16小时，其中1％的缺氧实验分为加药组(1％+LY294002)和不加药组。然后测定Luc活性。图8示出对真菌提取物的筛选结果。真菌提取物的浓度为10μg/ml。空白对照(Control)是正常氧气条件而且不加入真菌提取物的样品。阳性对照(Hyp)是缺氧条件(1％，16小时)但不加入真菌提取物的样品。Y轴上表明的是真菌提取物的编号。具体实施例方式本专利技术方法的工作原理。①HIF是抗肿瘤药物特别是抗肿瘤血管生成药物的重要靶点，HIF抑制剂具有抗肿瘤生长作用；②HIF是一种转录蛋白，不具有可直接的检测的活性，它只有与HRE结合后，促使其它基因如Luc的表达，从而来体现它的存在，因此，Luc的活性的高低也反映了HIF表达的高低；③HIF只有在低氧时才表现为转录蛋白的活性，通常指环境中的氧含量为0.5-3％时认为是低氧条件，这时HIF本身的表达增加，其下游基因如Luc表达也增加、活性增强；④LY294002是一种3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3K)的抑制剂，由于HIF的蛋白合成需要PI3K的参与，所以LY294002可以抑制HIF的表达，可作为HIF抑制剂的阳性对照药品；所有的实施例完全按上述的步骤操作。实施例1第一步①中，HRE的cDNA由聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)合成，其序列如图3所示，全长的HRE用限制性内切酶KpnI和XhoI切割，连接到用KpnI和XhoI预处理的带有Luc基因的质粒pGL3promotor上，重组的新质粒被命名为pHRELuc，并对插入序列测序检验是否正确；第一步②中，用Superfect转染试剂盒(Qiagen)，让重组质粒pHRELuc和带有新霉素(neomycin，neo)抗性的质粒pSV2neo共同转染人肝脏细胞HepG2，转染48小时后，用浓度为800μg/ml的neo类似物G418进行第一轮筛选，10天后，挑出具有neo抗性的稳定克隆，转染的细胞培养在含浓度为500ug/ml的G418的培养液中，然后利用有限稀释法在缺氧条件下进行第二轮筛选；第二步中，把缺氧条件处理后的细胞中的Luc活性用Luc检测试剂进行检测，比较同一克隆在缺氧(Hyp)和正常供氧(Nor)条件下的Luc活性，得到LucHyp∶LucNor比率，挑出LucHyp∶LucNor＞10的克隆(见图4)，即为转染成功的HepGHRE细胞株；第三步中，把HepGHRE细胞接种于96孔板，细胞贴壁后移入5％氧气浓度的缺氧条件中，缺氧条件持续0h-32小时，之后进行Luc活性的检测(见图5)，由于Luc的活性反映了HIF的表达，结果表明HIF在缺氧4小时后开始表达，在16小时后达到峰值，因此16小时的缺氧处理时间最适宜；确定缺氧时间后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以ＨＩＦ为靶点的抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步构建稳定表达ＨＲＥ和Ｌｕｃ的转染细胞株①构建含人ＨＲＥ和Ｌｕｃ基因的重组质粒；②转染人实体瘤或血癌细胞，获得稳定表达ＨＲＥ和Ｌｕｃ的转染细胞 株；第二步建立合适的磷光检测系统；第三步建立合适的低氧条件，在该条件时，转染细胞株的Ｌｕｃ活性增强；第四步进行以ＨＩＦ为靶点的抗肿瘤药物筛选用待筛选化合物作用于转染细胞，在合适的低氧条件下孵育一定 时间，检测Ｌｕｃ活性，如果待筛选化合物使细胞内的Ｌｕｃ活性减弱，说明该化合物可能是一种ＨＩＦ的抑制剂，具有抗肿瘤血管生成的作用，因此是一种抗肿瘤药物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周捷，陈菲，王弢，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]