本发明专利技术提供转录因子NFATC3的一种新用途，即：转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用，所述药物为NFATC3抑制剂，包括他克莫司、环孢菌素A或VIVIT，所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本发明专利技术的重要之处是发现了转录因子NFATC3与肿瘤多药耐药密切相关，以及NFATC3抑制剂对肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，且上述抑制剂本身毒副作用很小，因此，本发明专利技术为抗肿瘤多药耐药新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转录因子NFATC3的ー种新用途，尤其涉及转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
技术介绍
肿瘤是严重危害人类健康的ー类疾病，位居各类死因之首。目前我国患肿瘤人数众多，毎年死于肿瘤的人数超过160万。在我国现已批准上市的抗肿瘤药物大约有200多种，但随着肿瘤化疗药物的广泛应用，肿瘤的多药耐药问题凸显，已成为肿瘤化疗失败最常见而又难以解决的问题之一，据统计90%以上的肿瘤患者死于不同程度的耐药。 肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同吋，对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性，从而大大降低抗肿瘤药物的疗效。因此，研究MDR的产生机制，寻求有效的耐药逆转措施从而克服MDR现象已成为国内外的研究热点。跨膜蛋白介导的MDR为最经典的MDR产生机制，其中最常见的为P-糖蛋白。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)也称pl70糖蛋白，是由多药耐药基因MDRl所编码的ー种ATP依赖性膜转运蛋白，P-gp为ー种药物泵，能将多种药物泵出细胞外，使胞内药物聚积减少，从而减弱药物的细胞毒作用，最终使肿瘤细胞产生耐药性。P-gp主要介导亲脂性抗肿瘤药物引起的MDR，包括抗生素类如多柔比星/阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)，植物类药物如长春新碱(VCR)、依托泊苷(Vp216)等。根据MDR产生机制，选择特有的靶点设计合成直接作用于耐药肿瘤的新药进行靶向治疗，将对肿瘤的治疗非常有益。近几年，研究者发现了很多与肿瘤多药耐药相关的药物靶点，然而依据这些这些药物靶点研发或筛选出的耐药逆转剂通常具有严重的毒副作用，因而阻碍了它们在临床上的应用，因此，寻找新的肿瘤耐药相关靶点，并在此基础上设计筛选出高效低毒的多药耐药逆转剂亟不可待。NFATCnuclear factor of activated T cells)即活化T细胞核因子，属于一类转录因子家族，在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用。NFAT分为NFATC1-NFATC4四种亚型。NFAT在各种类型的免疫细胞(如B细胞、NK细胞、肥大细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞)以及肿瘤和构成肿瘤微环境的细胞内均有表达，其活性受到钙离子依赖性的钙调蛋白磷酸酯酶(Calcineurin)的调节,其活化过程分为三步脱磷酸、核易位、对DNA亲和カ的提高。在静止细胞中，NFAT蛋白被磷酸化而存在于细胞浆，对DNA具有低亲和力，在由任何因素弓丨起的细胞外钙内流的情况下(如由瞬时受体电位通道TRPC5介导的细胞外钙内流)，上述钙离子依赖性钙调蛋白磷酸酯酶将促使NFAT蛋白快速脱磷酸化并进入细胞核，入核后的NFAT对DNA的亲和カ增强。NFAT抑制剂如他克莫司(FK-506)、环孢菌素A(CyclosporinA)、VIVIT等可通过抑制上述钙调蛋白磷酸酯酶来阻断NFAT通路。目前，国内外未见有转录因子NFAT作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供转录因子NFATC3的ー种新用途，即转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。所述药物为NFATC3抑制剂，包括他克莫司、环孢菌素A或VIVIT。所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本专利技术的有益技术效果为 经本专利技术人研究发现，与敏感型肿瘤细胞(如MCF-7/WT)相比，介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白在多药耐药肿瘤细胞(如MCF-7/ADM)中有更高水平的表达，此外，预测并证实了转录因子NFATC3可与MDRl启动子区域相结合，在瞬时受体电位通道TRPC5介导的细胞外钙内流的激活作用下，转录因子NFATC3的转录活性增强从而上调p-gp的表达 水平，证明该转录因子与肿瘤多药耐药密切相关；实验结果表明，NFATC3抑制剂(FK-506、CyclosporinA, VIVIT)对肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，且上述抑制剂本身在使用剂量范围内毒副作用很小；因此，本专利技术为抗肿瘤多药耐药新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。附图说明图I为转录因子NFATC3的活化及活化后的NFATC3上调MDRl基因表达的过程示意图。图2为本专利技术实施例I中多药耐药肿瘤细胞中MDRl mRNA转录水平的检测结果示意图。图3为本专利技术实施例2中预测并证实转录因子NFATC3与MDRl启动子区域相结合的实验结果示意图。图4本专利技术实施例3中TRPC5介导的细胞外钙内流对转录因子NFATC3的激活作用的检测结果示意图。图5本专利技术实施例4中NFATC3抑制剂对肿瘤细胞多药耐药的逆转作用的实验结果示意图。具体实施例方式 下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进ー步的说明。如图I所示，转录因子NFATC3的活化过程分为三步脱磷酸、核易位、对DNA亲和カ的提高。在细胞外I丐通过I丐离子通道(ion channel)内流入胞衆(cytosol)的情况下，钙离子依赖性钙调蛋白磷酸酯酶(A B)将促使NFATC3快速脱磷酸化并进入细胞核(nucleus)，入核后的NFATC3与细胞核中MDRl基因的启动子(promotor)区域结合，通过调控该基因的mRNA转录水平来上调P-gp的表达水平。实施例I 实施例4所使用实验材料如下 细胞系野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT购自美国模式培养物寄存库(ATCC);耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM以及能稳定表达TRPC5的人胚胎肾细胞HEK293由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存。上述耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM制备方法为将新复苏的野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT细胞(购自ATCC)于细胞培养常规条件下培养2代 3代，使细胞生长稳定，待细胞汇合时用胰酶进行消化并传代，第二天更新培养基，同时以MCF-7/WT IC50的1/10为起始浓度加入阿霉素，于加药第二天再次换液，并维持阿霉素的浓度进行常规传代培养，待细胞稳定生长后提高药物浓度继续培养，直到细胞可在阿霉素浓度为5 μ g/ml的培养基中稳定生长，即得，整个制备过程历时8个月；上述能稳定表达TRPC5的人胚胎肾细胞HEK293制备方法为按常规实验操作方法，用EcoR I和Not I分别对TRPC5基因(由美国哈佛大学教授D. E. Clapham赠送，Gene ID:7224)和PCDNA6A载体(购自美国Addgene公司)进行双酶切，回收经双酶切的基因和载体片段，构建TRPC5和pCDNA6A的重组表达质粒pCDNA6A_TRPC5，并将该重组表达质粒转染人胚胎肾细胞HEK293 (购自 ATCC)所得。质粒与基因mdrl_luc购自美国Panomics公司，为突光素酶报告基因载体上携带有800bp MDRl启动子序列的质粒；pRL_CMV、pCDNA6A和pCDNA6A_NFATc3购自美国Addgene公司；绿色荧光蛋白GFP基因和NFATC3基因购自美国Addgene公司。试剂及试剂盒TrizolReagent 购自美国 Invitrogen 公司；Hot startFluo-PCR mix购自美国Bio-Rad公司；NFATC本文档来自技高网...
【技术保护点】
转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金坚，马鑫，陈蕴，何冬旭，蔡燕飞，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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