本发明专利技术公开了MAPK-ERK1/2信号通路抑制剂在制备去除或抑制肿瘤细胞中双微体药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明专利技术针对目前肿瘤治疗的效果欠佳，进而提供一种针对含有双微体的肿瘤的靶向生物治疗策略，以研究发现的恶性肿瘤细胞中双微体与ERK1/2蛋白激酶活性存在密切关系为理论依据，特异性地针对MAPK-ERK1/2信号转导通路异常而出现ERK1/2蛋白激酶持续磷酸化的含有双微体的肿瘤类型而提出本发明专利技术。本发明专利技术的方法提高了肿瘤治疗的特异性，是对现有治疗方案的改进，另一方面本发明专利技术也提出了一种双微体靶向治疗的策略。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种能够去除或抑制肿瘤细胞中双微体的药物，特别涉及一种能够去除或抑制MAPK-ERK1/2信号转导通路持续激活的恶性肿瘤细胞中双微体的药物。属于肿瘤生物治疗
技术介绍
双微体(doubleminutes 或 double minute chromosomes, DMs)是基因扩增的主要细胞遗传学标志，为细胞中位于染色体外、小的、成对存在的无中心粒的染色质小体，是染色体外遗传单位的一种主要存在形式。1962年首次在一些恶性肿瘤细胞和渗出液及肺癌胸水的转移细胞中发现这种染·色体外的微体。目前已在白血病、恶性淋巴瘤等多种血液系统肿瘤，和肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌及儿童神经母细胞瘤等实体性肿瘤中都可检测到双微体，双微体是恶性肿瘤基因扩增的主要的细胞遗传学标记。不同类型的肿瘤细胞中双微体具有较高的异质性，携带基因扩增使细胞具有选择优势，在各自不同的肿瘤中发挥抗凋亡、促进肿瘤细胞生长等作用。在肿瘤演进的晚期有重要作用，与各种癌症病人的不良预后及耐药性密切相关。肿瘤细胞常表现出细胞信号转导通路异常调节，而双微体的形成也是肿瘤细胞内外信号转导通路异常调节的表现形式。细胞内外信号转导通路中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族在肿瘤中表现出各种异常尤为突出。MAPKs信号转导通路中癌性突变最经常影响到的是ERK1/2通路，在大约1/3的人类癌症中都出现ERK1/2通路异常调节，关系肿瘤表型的多个方面。1983年SNAPKAM. R.等首次发现低浓度的羟基脲(HU)可以诱导双微体丢失，减少携带的DHFR基因的扩增拷贝数，降低肿瘤的恶性表型；至今Von HoffD. D.、Raymond E.、Guan X.、Shimizu N.和Prochazka P.等分别在研究中证实双微体会在选择压力下缓慢丢失。从肿瘤细胞中消除双微体上扩增的癌基因和耐药基因，降低其致癌性或恢复细胞对药物的敏感性，去除双微体是治疗以基因扩增为标志的疾病的可行途径。不足之处是在临床实际中也会将羟基脲应用于肿瘤治疗，但对肿瘤并没有较强的特异性，羟基脲半衰期短，高剂量，易产生快速耐受性。针对肿瘤的特点进行特异性治疗可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性，有的放矢，由于某些肿瘤细胞可检测到双微体的形成和MAPK-ERK1/2信号转导通路异常激活，针对这一特点对肿瘤细胞双微体形成密切相关的重要靶点进行干预，通过减少肿瘤细胞中双微体数目，从而控制肿瘤细胞的演进，针对肿瘤细胞中双微体的靶向性治疗将会成为一种新的肿瘤治疗策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前肿瘤治疗的效果欠佳，进而提供一种针对含有双微体的肿瘤的靶向生物治疗策略，可以特异性的针对MAPK-ERK1/2信号转导通路异常而出现ERK1/2蛋白激酶持续磷酸化的含有双微体的肿瘤类型。本专利技术人以研究发现的恶性肿瘤细胞中双微体与ERK1/2蛋白激酶活性存在密切关系为理论依据，通过研究发现，MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂能够去除或抑制肿瘤细胞中双微体。因此，本专利技术提出了 MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂在制备去除或抑制肿瘤细胞中双微体药物中的应用。在本专利技术中，优选的，所述的肿瘤细胞为MAPK-ERK1/2信号转导通路持续激活的恶性肿瘤细胞。 在本专利技术中，优选的，所述的MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂为U0126( I, 4-Diamino-2, 3-dicyano-l, 4-bis (o-aminophenylmercapto) butadiene, I, 4_ 二氨基-2, 3_ 二氰基-1，4-双(邻氨基苯巯基)丁二烯)，其化学结构式如式I所示。或I3D 98059(2-(2-Amino-3-methoxyphenyl) -4H-l-benzopyran-4_one，2_ (2_ 氨基-3-甲氧基苯基)-4H-1-苯·并吡喃-4-酮)，其化学结构式如式II所示。 NH2O NH2f2 ' ^ — NC yzzzJH2N以上所述的抑制剂可购自德国Calbiochem公司(U0126，货号#662005 ；PD 98059货号 #513000)。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为I、检测恶性肿瘤细胞的细胞遗传学特征从美国标准生物品收藏中心(ATCC)和文献报道选择以下含有双微体的恶性肿瘤细胞为研究对象，人卵巢癌细胞系UACC-1598，人结直肠腺癌细胞系NCI-H716、人结肠腺癌细胞系NCI-H508、人神经外胚层瘤细胞系SK-PN-DW、人髓性白血病细胞系HL-60和人胃腺癌细胞系NCI-N87。(I)常规细胞培养(2)细胞中期核型标本制备检测细胞株含有双微体的信息2、检测含有双微体的细胞的MAPK-ERK1/2信号转导通路活性状态在人类肿瘤中经常出现MAPK-ERK1/2信号转导通路持续性地被激活，MAPK-ERK1/2等多级蛋白激酶被异常激活，ERK1/2蛋白激酶持续处于磷酸化状态。因此，检测选择Western blotting技术，用针对ERKl/2Thr202/Tyr204位点的特异性抗体anti-phospho-ERKl/2(Thr202/Tyr204)抗体检测不同细胞中 ERKl/2Thr202/Tyr204 位点的磷酸化水平。3, MAPK-ERKI/2信号转导通路抑制剂对细胞中双微体的影响从上述实验确认人卵巢癌细胞UACC-1598中ERK1/2蛋白激酶处于持续磷酸化状态，用低浓度MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂持续作用此种细胞两周，检测细胞中双微体的变化。(I)双微体数目检测抑制剂作用后，常规进行中期核型制备，计数50-100个核型中的双微体。另有中期核型标本_20°C保存，以备用于后续荧光原位杂交(FISH)实验。(2)双微体携带基因扩增水平检测已知人卵巢癌细胞UACC-1598细胞中双微体上携带MCLl、MYCN和EIF5A2基因扩增，通过实时定量PCR (qPCR)方法和荧光原位杂交技术检测抑制剂作用下MCL1、MYCN和EIF5A2基因的扩增水平。4, MAPK-ERKI/2信号转导通路抑制剂对细胞生物学行为的影响(I)绘制细胞生长曲线检测加入抑制剂后的细胞增殖能力变化；(2)流式细胞术检测加入抑制剂后的细胞周期变化；分别收集加入抑制剂和对照组细胞，依cycle TEST PLUS DNA试剂盒提供的操作步骤进行，行流式细胞术检测细胞周期的改变。(3)细胞克隆形成能力检测；(4)细胞侵袭能力检测。应用BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber对抑制剂和对照组细胞进行重组基底膜侵袭实验。由此方案可特异性的针对MAPK-ERK1/2信号转导通路异常而出现ERK1/2蛋白激酶持续磷酸化的含有双微体的肿瘤，用MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂通过减少细胞中双微体的数目而降低肿瘤细胞的恶性程度。相较于现有技术本专利技术方法的有益效果是对于双微体阳性的肿瘤细胞的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，提高了治疗的特异性。特异针对含有双微体并且ERK1/2蛋白激酶处于持续磷酸化的恶性肿瘤细胞，用MAPK-ERK1/2细胞转导通路抑制剂作用通过减少肿瘤细胞中的双微体数目及携带癌基因的扩增而降本文档来自技高网...
【技术保护点】
MAPK？ERK1/2信号转导通路抑制剂在制备去除或抑制肿瘤细胞中双微体药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：傅松滨，孙文靖，于旸，金焰，孟祥宁，白静，全超，关荣伟，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：
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