本发明专利技术公开了一种ERK信号通路抑制剂NdpA，属于细胞生物学领域。本发明专利技术确定了可以抑制ERK信号通路的肺炎克雷伯杆菌分泌蛋白NdpA，并且发现NdpA通过直接结合ERK并抑制其磷酸化而实现对ERK信号通路的抑制。本发明专利技术成果可为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，尤其在抗肿瘤、缓解动脉粥样硬化和痛风等多种药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开发ERK的抑制剂。此外，该成果还对寻找新的抗感染药物靶点和筛选新药具有重要的理论意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种ERK信号通路抑制剂NdpA，尤其是一种能抑制ERK信号通路的肺炎克雷伯杆菌分泌蛋白，属于细胞生物学领域。
技术介绍
炎症，也就是人们常说的“发炎”，本是机体对外界刺激产生的一种保护性反应，其临床表现为：红、肿、热、痛和功能性障碍。通常情况下，炎症对机体是有益的，但是有些时候，炎症也是某些疾病的罪魁祸首。丝裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应通路是真核细胞信号传递的重要途径之一。在哺乳动物细胞中，几乎所有的生长因子和细胞因子都可以激活该途径，并启动早期应答基因的表达。MAPK信号通路可以被多种应激原(如病原产物、促炎因子、渗透压、机械刺激等)激活，最终磷酸化大量蛋白质，包括转录因子、细胞骨架蛋白、激酶和其他酶类，因而极大地影响了细胞的代谢、形态、生长、生存和分裂等功能。细胞外信号调节激酶(The extracellular signal-regulated kinase,ERK)是MAPK家族中首先被鉴定出来的成员，包括分子量为44kDa的ERK1、分子量为42kDa的ERK2等多种亚型，它们有90％的同源性，其保守的磷酸化位点为Thr185-Glu-Tyr187(ERK2)或Thr203-Glu-Tyr205(ERK1)。ERK信号通路可被胰岛素和各种生长因子通过受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)激活。当受体结合配基被活化后，小G蛋白Ras便会释放GDP并结合GTP而被活化，活化的Ras随即招募MAP3K家族成员Raf到质膜，并激活两个ERK特异性激活剂MEK1和MEK2。除了沿着Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2途径激活外，ERK信号通路还可以被促炎因子和病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMMs)激活，如TNFα和LPS。此外，ERK信号通路还可以被身体内的“危险信号”激活，如动脉粥样硬化患者的氧化型低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)和痛风患者的尿酸结晶。已有大量实验证实ERK信号通路的活性与多种病理过程及重要疾病密切相关，包括：炎症反应、肝脏疾病、风湿性关节炎、肥胖症和糖尿病等代谢性疾病以及肿瘤等。因此，ERK1/2可作为潜在的药物靶点，ERK1/2的抑制剂对多种疾病的治疗也将取得很好的临床效果。肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)属于肠杆菌科(Enterrobacteriace)克雷伯菌属(Klebsiellae)，在自然界分布很广泛。近几年，肺炎克雷伯杆菌成为了仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌，严重威胁着人类的健康，常引起医院和社区获得性感染。肺炎克雷伯杆菌通常聚集在人类的皮肤、咽、胃肠道、伤口、尿道和呼吸道，其中在医院内感染中，该菌最常出现在呼吸道和尿道。肺炎克雷伯杆菌倾向于感染免疫力低下的群体，例如老人和儿童。当机体抵抗力低下或服用免疫抑制剂以及长期大量服用抗生素导致菌群失调时，该病原菌易感染宿主致病，如肺炎、败血症、肝脓肿、脑膜炎、泌尿系统发炎或是伤口感染。而且在肺炎克雷伯杆菌感染的早期阶段，宿主的炎症反应受到了抑制。由于具有快速传播的特点，肺炎克雷伯杆菌在医院有着爆发的态势。类核相关蛋白(Nucleoid-associated proteins)是一类广泛存于革兰氏阴性细菌中非常保守的蛋白，参与细菌DNA的构象改变、复制、重组、修复和转录。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种ERK信号通路抑制剂，旨在抑制ERK1/2磷酸化，使其上游激活剂MEK1不能与ERK1/2相互作用，从而抑制ERK1/2磷酸化。所述抑制剂是肺炎克雷伯杆菌分泌蛋白NdpA，其氨基酸序列如(a)或(b)或(c)：(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有抑制ERK信号通路活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。所述抑制剂能抑制细胞外信号调节激酶ERK1/2的磷酸化。本专利技术还提供一种ERK信号通路抑制剂突变体，是在SEQ ID NO.1所示序列基础上，将第15位的赖氨酸K突变为丙氨酸A，或将第16位的精氨酸突变丙氨酸A，或将第23位的亮氨酸L突变为谷氨酸E。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供所述抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)构建含有编码NdpA蛋白的基因的重组质粒pET-28a-NdpA，并将质粒转化到大肠杆菌BL21中，在30℃以IPTG诱导蛋白表达；(2)超声破菌，高速离心后收取上清液，将上清液流过填充好的Ni-NTA Agarose中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入含有咪唑的洗脱液洗脱蛋白，将收集的洗脱液加入到10kD的蛋白浓缩管中，离心浓缩；(3)在蛋白浓缩管中加入PBS混匀后离心、分装蛋白，先用液氮速冻，再放到-80℃保存待用。本专利技术提供ERK信号通路抑制剂可用于筛选、制备治疗ERK信号通路相关的疾病的药物，或用于筛选、制备抗肿瘤、缓解动脉粥样硬化和痛风的药物，或用于筛选、制备治疗肺炎克雷伯杆菌导致的感染性疾病的药物。本专利技术发现肺炎克雷伯杆菌分泌性效应蛋白NdpA通过抑制ERK1/2磷酸化而抑制ERK信号通路。本专利技术发现NdpA通过自身的D模序与ERK1/2直接结合，导致MEK1不能与ERK1/2相互作用，使得ERK1/2不能磷酸化激活。由于临床上多种疾病的发生都与ERK信号通路的异常激活相关，因此控制ERK1/2的磷酸化水平有利于治疗很多疾病。本专利技术成果将来可为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，尤其在抗肿瘤、缓解动脉粥样硬化和痛风等多种药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开发ERK信号通路的抑制剂。此外，该成果还对寻找新的抗肺炎克雷伯杆菌等病原导致的感染性疾病的药物靶点和筛选新药具有重要的实际意义。附图说明图1：(A)NdpA抑制ERK信号通路，每组数据(平均值±标准误差)至少代表3个独立的实验，*P<0.05,**P<0.01(双尾未配对t检验)；(B)NdpA抑制ERK1/2磷酸化。图2：NdpA与ERK1/2相互作用。图3：NdpA抑制MEK1和ERK1/2的相互作用。图4：(A)D模序的突变体NdpA(L21E)显著地削弱了NdpA对ERK信号通路的抑制作用，每组数据(平均值±标准误差)至少代表3个独立的实验，*P<0.05,**P<0.01(双尾未配对t检验)；(B)D模序的突变体NdpA(L21E)不能有效结合ERK1/2；(C)突变体NdpA(L21E)不能有效抑制ERK1/2的磷酸化。具体实施方式由于ERK1和ERK2高度相似，其同源性高达90％，且细胞中ERK2的含量远高于ERK1，所以以下是实施例采用ERK2，ERK2基因序列如GeneID:5594所示。MEK1基因的序列如GeneID:5604所示。实施例1 NdpA对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ERK信号通路抑制剂，其特征在于，氨基酸序列如以下(a)或(b)或(c)所示：(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有ERK信号通路抑制活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。
【技术特征摘要】
1.一种ERK信号通路抑制剂，其特征在于，氨基酸序列如以下(a)或(b)或(c)所示：(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有ERK信号通路抑制活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。2.权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，直接与ERK1/2结合，抑制MEK1和ERK1/2的结合，从而抑制ERK1/2被MEK1磷酸化激活。3.一种ERK信号通路抑制剂，其特征在于，是在SEQ ID NO.1所示序列基础上，将第15位的赖氨酸K突变为丙氨酸A，或将第16位的精氨酸突变丙氨酸A，或将第23位的亮氨酸L突变为谷氨酸E。4.一种制备要求1-3任一所述的抑制剂的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠华，许光华，汪静，李冰曦，严景华，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。