一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽及其应用。本发明专利技术构建了一个靶向抑制ERK信号通路的小分子多肽，通过一系列生物学实验证明该小分子多肽在多种肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌中均能有效克服PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物在抗肿瘤治疗过程中出现的耐药，有显著的协同抗肿瘤作用，由于ERK信号通路存在于多种肿瘤中，是促进细胞生长以及肿瘤发生、发展的重要信号通路之一，因此该小分子多肽可用于此类肿瘤的治疗，优选与PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物联合使用。

【技术实现步骤摘要】
一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽及其应用
本专利技术涉及分子生物学及生物医药
，具体地说，涉及一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽及其应用。
技术介绍
磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是目前发现的最为重要的促进细胞生长以及肿瘤发生、发展的信号通路之一，因此，很多临床前或临床中正在使用的药物，包括化疗药、靶向治疗药物等都被设计或者被证明通过抑制AKT信号途径从而达到抗肿瘤的效果。但人们发现，这类药物在经过初期较好的抗肿瘤效应后，往往会产生药物耐受而失效。我们的研究发现，使用PI3K/AKT的抑制剂，如MK2206、NVP-BEZ235处理前列腺癌细胞后，虽然能显著抑制AKT的激活，但却会导致细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)信号通路的激活，两者之间存在负反馈调节平衡，见图1。除此之外，该种负反馈调节平衡还存在于乳腺癌、结肠癌、直肠癌等其他类型肿瘤中。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)的最重要的亚家族成员，而MAPK也是目前已知的重要的促细胞生长、促肿瘤信号通路。这提示我们，ERK被负反馈激活是PI3K/AKT抑制剂出现耐药的重要分子生物学机制。然而，目前AKT与ERK信号途径之间的负反馈调节机制仍不清楚，也未见使用PI3K/AKT抑制剂抗肿瘤治疗的同时通过抑制ERK信号通路来提高药物治疗效果的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽。本专利技术提供了一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了一种分离的核酸分子，它编码序列如SEQIDNO.2所示的多肽。作为本专利技术的一个优选例，所述的核酸分子的序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术提供了一种表达载体，所述的表达载体包含有如上所述的核酸分子。本专利技术提供了一种药物组合物，它含有序列如SEQIDNO.2所示的多肽，和药学上可接受的载体。作为本专利技术的一个优选例，所述的药物组合物还包含PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物。本专利技术提供了所述的多肽、所述的核酸分子、所述的表达载体或所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。作为本专利技术的一个优选例，所述的肿瘤中AKT与ERK信号途径之间存在负反馈调节。更优选地，所述的肿瘤为前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌或胰腺癌。本专利技术还提供了所述的多肽、所述的核酸分子、所述的表达载体或所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述的药物用于克服PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物在抗肿瘤治疗过程中出现的耐药。本专利技术优点在于：本专利技术构建了一个靶向抑制ERK信号通路的小分子多肽P2SE，通过一系列生物学实验证明P2SE在多种肿瘤(前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌)中均能有效克服PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物在抗肿瘤治疗过程中出现的耐药，有显著的协同抗肿瘤作用。由于ERK信号通路存在于多种肿瘤中，是促进细胞生长以及肿瘤发生、发展的重要信号通路之一，因此小分子多肽P2SE可用于此类肿瘤的治疗，优选与PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物联合使用。附图说明图1.LNCaP、C4-2、C4-2B为三种前列腺癌细胞。MK2206：0.5μM，NVP-BEZ23550nM，处理24小时后收集细胞提取蛋白，westernblot检测。显示MK2206、NVP-BEZ235处理前列腺癌细胞后，虽然能显著抑制AKT的激活，但却会导致ERK信号通路的激活。图2.能与支架蛋白IQGAP1的CC结构域结合的FOXO1片段的氨基酸序列的鉴定。图3.pCMV-HA载体图谱。图4.CHX10μg/ml，预处理30min，MK22060.5μM，处理6小时后收集细胞提取蛋白，westernblot检测。图5.MK22060.5μM，持续处理48小时，MTS检测吸光度。图6.MK22060.5μM，处理6小时后收集细胞提取蛋白，westernblot检测。图7.左图：PTX10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白，westernblot检测。右图：LNCaP细胞，DTX10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白，westernblot检测。图8.左图：PC3细胞，DTX10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白，westernblot检测。右图：免疫荧光检测，表明PC3稳定株中P2SE多肽稳定表达。绿色荧光：HA；蓝色荧光：DAPI。图9.左图：Xenogen活体成像系统动态观察肿瘤荧光强度。右图：DTX处理24天后处死，各组肿瘤大小情况。图10.各组小鼠在0天和24天时肿瘤荧光强度对比。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。本专利技术的专利技术人通过研究发现叉头转录因子1(FOXO1)掌控、平衡肿瘤细胞中AKT与ERK信号途径之间的负反馈调节：当AKT激活时，FOXO1被AKT磷酸化，并被转移至细胞浆中，细胞浆中的FOXO1与支架蛋白IQGAP1的CC结构域结合从而抑制了ERK的激活；反之，当AKT被抑制，FOXO1从细胞浆转移至细胞核内，解除了与CC结构域的结合，从而ERK信号通路被激活。提示在使用PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物抗肿瘤治疗的同时抑制ERK信号通路，将是克服耐药、提高该类药物治疗效果的关键。因此，专利技术人设计了一个能与支架蛋白IQGAP1的CC结构域特异性结合的多肽，在细胞及动物体内表达该多肽，进行了一系列生物学实验，验证了该多肽具备显著的抗肿瘤效果。实施例1构建pCMV-P2SE质粒参见图2，利用GST-PULL技术鉴定了能与支架蛋白IQGAP1的CC结构域结合的FOXO1片段的氨基酸序列：NDDFDNWSTFRPRTSSNASTISGRLSPIMT(SEQIDNO.1)。利用pCMV-HA载体(购于Clontech公司，载体图谱见图3)构建表达该序列的质粒，并将第319位点上的丝氨酸(S)点突变为谷氨酸(E)，达到模拟磷酸化状态的目的，即：NDDFDNWSTFRPRTSENASTISGRLSPIMT(SEQIDNO.2)。我们将构建的质粒命名为pCMV-P2SE，所表达的多肽(序列如SEQIDNO.2所示)命名为P2SE。pCMV-P2SE质粒的构建方法为：用EcoRI和XhoI酶酶切pCMV-HA载体，与P2SE的表达序列(CTATTATTAAAATTACTAACCTCATGAAAAGCAGGAGCATGATCACTTCTACGATCATGATAATCACCAGCAAATTCAGGATAATACTGA，SEQIDNO.3)进行连接得到pCMV-P2SE质粒，测序验证正确。实施例2P2SE在前列腺癌细胞中抑制了MK2206引起的ERK信号途径的激活在前列腺癌细胞LNCaP中转染pCMV-P2SE质粒，细胞体内表达P2SE多肽。结果发现：MK2206处理的LNCaP细胞p-AKT受抑制，p-ERK显著升高；而在转染表达P2SE多肽的细胞，p-AKT受抑制的同时，p-ERK并没有出现激活。同时用CHX处理细胞，以排除P2SE的核转录功能引起的上述作用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的序列如SEQIDNO.3所示。4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含有权利要求2所述的核酸分子。5.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的多肽，和药学上可接受的载体。6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包含PI3K/AKT抑制剂类药物。7.权利要求1所述的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。8.权利要求2所述的核酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用。9.权利要求4所述的表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用。10.权利要求5所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。11.根据权利要求7-10任一所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘春武，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属新华医院，
类型：发明
国别省市：上海;31