TFPR1蛋白及其编码基因与其在免疫调节中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种TFPR1蛋白及其编码基因与其在免疫调节中的应用。本发明专利技术提供了一种蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列2自N末端第13-157位氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)或(b)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质；以及该蛋白及衍生物作为免疫调节活性蛋白和佐剂的应用。本发明专利技术的实验证明，TFPR1是一种具有免疫调节活性的蛋白，有望作为新型佐剂应用与疫苗的研发与生产。

【技术实现步骤摘要】
TFPR1蛋白及其编码基因与其在免疫调节中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及TFPR1蛋白及其编码基因与其在免疫调节中的应用。
技术介绍
疫苗接种是预防传染病的最有效的途径。传统疫苗主要包括减毒活疫苗和灭活疫苗，新型疫苗包括亚单位疫苗(subunitvaccine)、结合疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗。新型疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答。由于机体对不同病原体的保护性免疫应答是不同的，研发能诱导针对不同病原保护性应答的疫苗需要不同的佐剂。一直广泛应用于人群疫苗的、美国FDA批准的铝盐佐剂对于许多新型疫苗佐剂活性较差，尤其是其诱导的细胞免疫较弱，对于小分子的抗原无佐剂活性，不能满足新型疫苗发展的需要。新型疫苗佐剂的组成形式多样,来源也不同,主要包括油/水乳剂型、颗粒型、微生物衍生物型佐剂等。迄今为止,已批准上市的新型疫苗佐剂仅有少数几种:MF59、AS04等。MF59是一种由Chiron公司研发的水包油乳剂,在高压条件下将鲨烯与Tween-80和Span85混合后进行微流化,进而形成均一的小滴状乳液，已在欧洲国家批准用于流感亚单位疫苗。该佐剂比铝盐具有更好的免疫效果，但不良反应增加。AS04是2005年2月葛兰素史克公司研发的，是一种乳剂，其新型佐剂系统AS04的乙型肝炎疫苗Fendrix获欧盟批准上市,安全性良好,但临床报道的局部不良反应与其他乙肝疫苗类似,包括注射部位疼痛、头痛和疲乏。这些油/水乳剂型的佐剂都在着较明显的不良反应。寻找一种需要剂量低、安全、有效的佐剂具有重要意义。Triflin是蛇毒中的一种主要成分，属于CAP家族蛋白，主要由两个部分组成，即N端的PR-1结构域及C端富含半胱氨酸结构域(cysteine-richdomain，CRD)，二者之间由特定的连接区(hingeregion)组成。C-端的CRD区Cys在进化上十分保守，可形成8对二硫键，其中的10个Cys聚集于C端三分之一处，形成一个结构紧凑、功能重要的结构域，可能与阻断离子通道相关等功能相关。N端由进化高度保守的结构域PR-1组成，最初是在植物中发现，与植物抵抗各种病原生物感染密切相关，随后发现该保守结构广泛分布于各种生物中，功能不清。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的种蛋白质，命名为TFPR1，是如下(a)或(b)或(c)：(a)氨基酸序列为序列表中序列2的蛋白质；(b)氨基酸序列为序列表中序列2第13-157的蛋白质；(c)将(a)或(b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)或(b)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述序列表中的序列2由157个氨基酸残基组成。为了使1)中的TFPR1便于纯化，可在其氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签，但不限于如下标签。表1为标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述2)中的TFPR1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的TFPR1的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码上述蛋白的DNA分子也是本专利技术保护的范围。上述DNA分子为如下1)-3)中任一种DNA分子：1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本专利技术保护的范围；所述重组载体具体为将上述DNA分子插入表达载体，得到表达上述蛋白质的载体。在本专利技术的实施例中，表达载体为pET-TFPR1，将pET-His的BamHI和HindIII识别位点间的DNA替换为序列表中序列1所示TFPR1，保持pET-His的其它序列不变得到的重组载体，将该载体命名为重组载体pET-TFPR1。pET-TFPR1表达序列2所示的带有标签his的重组蛋白TFPR1。扩增上述DNA分子或其任意片段的引物对也是本专利技术保护的范围。上述的蛋白质、上述的DNA分子在制备免疫调节剂中的应用也是本专利技术保护的范围。上述免疫调节剂具有激活免疫细胞产生Th1型和/或Th2型细胞因子的功能；所述Th1型和/或Th2型细胞因子具体为IFNγ、IL-6和/或IL-10。其中，IFNγ、IL-6为Th1型细胞因子。上述的蛋白质、上述的DNA分子在作为抗原佐剂或疫苗佐剂中的应用也是本专利技术保护的范围。上述应用中，所述抗原为蛋白或多肽，所述疫苗为蛋白疫苗或多肽疫苗。上述应用中，所述佐剂具有如下1)和/或2)所示的功能：1)能诱导抗原产生体液免疫和/或细胞免疫；2)能诱导免疫细胞产生Th1型和/或Th2型细胞因子。本专利技术通过生物信息学分析，设计了仅保留免疫调节作用和佐剂活性的145Aa残基的TFPR1，经过大肠杆菌密码子优化后的基因TFPR1，并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白TFPR1。体外研究表明，TFPR1具有免疫调节作用，可以结合人和小鼠的抗原递呈细胞等多种免疫细胞，诱导Th1型为主的Th1/Th2型细胞因子的产生。体内研究表明，TFPR1可以有效增强多种不同类型的抗原(如蛋白抗原OVA、HBsAg以及合成多肽HIV-1多肽抗原PEP5)的免疫原性。TFPR1作为蛋白抗原的佐剂效果优于铝佐剂，可同时诱导体液和细胞免疫：与铝佐剂相比，其诱导的特异性抗体IgG和IgG1水平相近，但能诱导较高的水平的IgG2a，说明其能诱导Th1偏倚的Th1/Th2免疫应答；同时TFPR1可诱导细胞免疫。TFPR1作为多肽抗原的佐剂效果显著优于铝佐剂：TFPR1显著增强多肽抗原诱导的特异性体液和细胞免疫，而铝佐剂作用较弱。以上结果表明TFPR1是一种具有免疫调节活性的蛋白，有望作为新型佐剂应用与疫苗的研发与生产。附图说明图1为原核表达载体pET-TFPR1的酶切鉴定图2为重组蛋白TFPR1的诱导表达与纯化产物的SDS-PAGE鉴定图3为TFPR1的纯化与WB鉴定图4为TFPR1与小鼠脾细胞结合试验图5为TFPR1体外激活小鼠脾脏细胞细胞因子水平图6为TFPR1人PBMC体外结合试验和激活试验图7为TFPR1作为模式抗原OVA佐剂活性分析。图8为TFPR1作为HBsAg蛋白佐剂活性分析图9为TFPR1作为HIV-1多肽佐剂的活性分析图10为体内预存的抗TFPR1抗体对TFPR1佐剂活性的影响具体实施方式下述实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)：(a)氨基酸序列为序列表中序列2的蛋白质；(b)氨基酸序列为序列表中序列2第13‑157的蛋白质；(c)将(a)或(b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)或(b)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
2014.03.05 CN 20141007913091.蛋白质或DNA分子在制备免疫调节剂中的应用；所述蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)氨基酸序列为序列表中序列2的蛋白质；(b)氨基酸序列为序列表中序列2第13-157的蛋白质；所述DNA分子为编码区为序列表中序列1所示的DNA分子。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述免疫调节剂具有激活免疫细胞产生Th1型和/或Th2型细胞因子的功能；所述Th1型和/或Th2型细胞因子具体为IFNγ、IL-6和/或IL-...

【专利技术属性】
技术研发人员：寇志华，周育森，孙维来，杨裔，郭晶晶，于虹，郭彦，李军锋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11