【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及新型免疫治疗药物的研究与构建，具体涉及一种靶向lag-3的全氟化碳环肽免疫治疗纳米药物，属于纳米药物。
技术介绍
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技术介绍
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1、免疫治疗目前在晚期肿瘤的治疗中已占据一席之地，特别是在非小细胞肺癌的临床治疗中应用范围逐渐扩大。但是在实际应用中研究者们发现，免疫治疗起效时间慢，不适合病情迅速的患者，以及部分患者治疗效果不显著等问题。此外，肿瘤免疫治疗价格昂贵，大部分患者难以承受巨大的诊疗费用。
2、lag-3是重要的免疫检查点，它以高亲和力与mhc ii(主要组织相容性复合体ii类分子)，lsectin，fgl1，纤维介素蛋白1等结合，负性调节t细胞的增殖和细胞因子(如il2、ifn-γ、tnf)分泌，抑制t细胞抗肿瘤活性。
3、免疫检查点阻断抗体具有高特异性，但存在高免疫原性副作用、低肿瘤穿透性、高治疗成本等缺点；而免疫检查点阻断多肽具有多种优势，包括，较小分子量、低免疫原性、较好的组织和肿瘤渗透性以及较低的合成成本等。相对于阻断抗体，多肽的先天的劣势是容易被血浆中的酶降解或被体内的肾小球清除，导致其半衰期较短。而与线性肽相比，环肽具有更稳定的空间结构和更长的体外半衰期。郑州大学生命科学院高艳峰教授发现的靶向lag-3的环形多肽c25，靶向性好，可以做活体靶向治疗。
4、全氟化碳(pfc)号称人工血液替代品，具有较高的氧溶解性及疏水性，是构建经呼吸道递送纳米分子成像探针的最优选择，且其安全性及生物相容性已被研究者们充分证实。
技术实现
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技术实现思路
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1、免疫治疗已取得突破性进展，其中免疫检查点抑制剂凭借细胞毒性杀死肿瘤，破坏t细胞自身抑制信号而重新激活机体抗肿瘤免疫应答。本专利技术涉及新型免疫治疗药物的研究与构建，尤其涉及纳米药物的合成方法和使用。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案之一，是一种可经呼吸道递送的免疫治疗纳米药物pfc-c25，由包裹全氟化碳(pfc)的脂质膜上的氨基与免疫检查点阻断环肽c25中的羧基进行氨基羧基缩合反应而获得，，以实现高效、经济的经呼吸道肺原位癌免疫治疗；
3、所述环形多肽c25分子式如式(i)所示：
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5、本专利技术提供的技术方案之二，是所述免疫治疗纳米药物pfc-c25的制备方法，具体地，包括如下步骤：
6、(1)制备全氟化碳纳米乳液；
7、(2)采用全氟化碳纳米乳液与环形多肽c25进行氨基羧基缩合反应制备pfc-c25；
8、进一步地，将全氟化碳(pfc)、脂质、甘油、水按比例超声混合均匀，使用脂质体挤出机制成全氟化碳(pfc)纳米乳液；
9、更进一步地，按如下重量份数将全氟化碳(pfc)60-80份、脂质3～5份、甘油3～6份、水150～170份用探头超声混合均匀，使用脂质体挤出机制成全氟化碳(pfc)纳米乳液；
10、进一步地，所述全氟化碳(pfc)选自溴化全氟辛烷(pfob，perfluorooctylbromide)、全氟-15-冠醚-5(pfce)、fc-3280(c8f18)以及fc-77(c8f16o))中的至少一种；
11、优选地，所述全氟化碳选自全氟-15-冠醚-5(pfce)；
12、进一步地，所述脂质的制备方法如下：将磷脂类表面活性剂，用氯仿或者氯仿与甲醇的混合溶剂进行充分溶解，加入罗丹明和胆固醇后，通过旋转蒸发仪蒸干，并在真空烤箱中过夜烘干，获得脂质；
13、所述磷脂类表面活性剂、罗丹明和胆固醇的摩尔比为86-92:0.05-0.2:8-12；
14、进一步地，真空烤箱烘干温度为37～42℃；
15、进一步地，将上述获得的脂质按比例加入甘油和水，通过机械分散或超声震荡的方式进行分散；再按比例加入全氟化碳(pfc)，用探头超声混合均匀，使用脂质体挤出机制成全氟化碳(pfc)纳米乳液；
16、更进一步地，所述的磷脂类表面活性剂包括磷脂酰胆碱类脂质，磷脂酰乙醇胺类脂质，磷脂酰甘油类脂质，磷脂酰丝氨酸或卵磷脂中的一种或几种的组合；
17、所述的磷脂酰胆碱类脂质包括：l-α磷脂酰胆碱(soy-pc95％)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、二月桂酰磷脂酰胆碱(dlpc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二花生酰磷脂酰胆碱(dapc)以及棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)；
18、所述的磷脂酰乙醇胺类脂质包括：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(dlpe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、1，3-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(1,3-dppe)、二植酰磷脂酰乙醇胺(dpype)以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)；
19、所述的磷脂酰甘油类脂质包括:二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)；
20、优选地，所述的磷脂类表面活性剂选自l-α-磷脂酰胆碱(soy-pc95％)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)；
21、优选地，所述的磷脂类表面活性剂选自大豆磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱dppc中的至少一种。
22、进一步地，采用全氟化碳纳米乳液与环形多肽c25进行氨基羧基缩合反应制备pfc-c25的方法具体如下：
23、①调节全氟化碳纳米乳液的ph至6-6.5；
24、进一步地，采用2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲液(mes buffer，ph＝6.0)调节ph；
25、更进一步地，每2ml全氟化碳纳米乳液加入100μl的mes buffer(ph＝6.0)；
26、②将步骤①获得的全氟化碳纳米乳液，与n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)按照2ml：8-10mg：5-10mg的比例混合；
27、③按每2ml全氟化碳纳米乳液加入20-22mg环形多肽c25的比例，将c25加入到步骤②获得的混合物中，避光，反应45min～90min；之后加终止剂乙醇胺2-3滴；
28、④采用透析的方式去除未反应的组分，得到能够靶向免疫检查点lag-3的纳米药物pfc-c25；
29、进一步地，采用100kd(分子量10万)透析袋透析后即得pfc-c25。
30、进一步地，采用外分光光度计检测，pfc-c25在270nm处显示出c25特征峰，表明成功构建负载c25环肽的pfc-c25纳米免疫治疗药物。
31、本专利技术提供的技术方案之三，是纳米药物pfc-c25的应用，特别是在制备经呼吸道递送肺原位癌免疫治疗药物中的应用。
32、有益效果：
33、(1)本专利技术构建的pfc-c25免疫治疗药物可高负载c25环肽，经uv-vis测定负载c25的浓度可以达到本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种免疫治疗纳米药物PFC-C25，其特征在于，由包裹全氟化碳的脂质膜上的氨基与免疫检查点阻断环肽C25中的羧基进行氨基羧基缩合反应而获得。
2.如权利要求1所述的一种免疫治疗纳米药物PFC-C25，其特征在于，所述免疫治疗纳米药物PFC-C25可经呼吸道递送。
3.权利要求1所述免疫治疗纳米药物PFC-C25的制备方法，其特征在于，步骤如下：
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，按如下重量份数将全氟化碳60-80份、脂质3～5份、甘油3～6份、水150～170份用探头超声混合均匀，使用脂质体挤出机制成全氟化碳纳米乳液；
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述全氟化碳选自溴化全氟辛烷、全氟-15-冠醚-5、FC-3280以及FC-77中的至少一种；
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的磷脂类表面活性剂包括大豆磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC中的至少一种。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用全氟化碳纳米乳液与环形多肽C25进行氨基羧基缩合反应制备PFC-C25的
8.权利要求1所述免疫治疗纳米药物PFC-C25的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，是在制备经呼吸道递送肺原位癌免疫治疗药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种免疫治疗纳米药物pfc-c25，其特征在于，由包裹全氟化碳的脂质膜上的氨基与免疫检查点阻断环肽c25中的羧基进行氨基羧基缩合反应而获得。
2.如权利要求1所述的一种免疫治疗纳米药物pfc-c25，其特征在于，所述免疫治疗纳米药物pfc-c25可经呼吸道递送。
3.权利要求1所述免疫治疗纳米药物pfc-c25的制备方法，其特征在于，步骤如下：
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，按如下重量份数将全氟化碳60-80份、脂质3～5份、甘油3～6份、水150～170份用探头超声混合均匀，使用脂质体挤出机制成全氟化碳纳米乳液；
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙夕林，吴丽娜，阿荣，周梅芳，王浩宇，王凯琦，杨丽丽，王凯，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：
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