一种重组表达的ADAM15h融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种真核细胞重组表达的去整合素金属蛋白酶ADAM15完整胞外段及其制备方法与应用，目的是提供一种可用于生产、研究用的ADAM15蛋白。本发明专利技术所提供的重组ADAM15h蛋白，是由pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系后表达得到的ADAM15h融合蛋白。本发明专利技术提供了该重组ADAM15h融合蛋白的制备方法，即用pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系，被转化的宿主细胞系经培养筛选出重组ADAM15h高效表达克隆，得到重组ADAM15h融合蛋白。本发明专利技术还提供了从细胞培养上清中纯化ADAM15h融合蛋白的方法及利用切割荧光底物检测重组ADAM15h酶活的活性检测方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种真核细胞重组表达的去整合素金属蛋白酶ADAM15完整胞外段及其制备方法与应用，目的是提供一种可用于生产、研究用的ADAM15蛋白。本专利技术所提供的重组ADAM15h蛋白，是由pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系后表达得到的ADAM15h融合蛋白。本专利技术提供了该重组ADAM15h融合蛋白的制备方法，即用pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系，被转化的宿主细胞系经培养筛选出重组ADAM15h高效表达克隆，得到重组ADAM15h融合蛋白。本专利技术还提供了从细胞培养上清中纯化ADAM15h融合蛋白的方法及利用切割荧光底物检测重组ADAM15h酶活的活性检测方法。【专利说明】—种重组表达的ADAM15h融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体的说，本专利技术涉及一种重组融合表达的去整合素金属蛋白酶ADAM15片段及其制备方法与应用，特别涉及一种可以在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中可溶、稳定表达的ADAM15h及其制备方法与应用。
技术介绍
金属蛋白酶去整合素家族(ADisintegrin And Metalloproteinase, ADAM),又称 MDC (metalloproteinase/disintergrin/cystein-rich),是近年来新发现的一类含有多个功能结构域的跨膜糖蛋白家族。该家族蛋白与蛇毒金属蛋白酶(snake venom metalloproteinase,SVMP)家族具有很高的同源性，其结构相似，通常由800-1200个氨基酸组成，包括前导域、类金属蛋白酶功能域、去整合素功能域、富含半胱氨酸功能域、类表皮生长因子功能域、跨膜域和C端的胞质尾区结构域等。ADAM家族蛋白在细胞间相互识别和相互作用中发挥重要作用。研究表明，ADAM蛋白在多种组织和器官中表达分布，参与了多种生理、病理过程，如精卵结合、神经发育、肌管形成等。在细胞外基质蛋白的水解、细胞间和细胞与基质间的粘连、细胞融合、迁移、信号传导、生物活性因子释放等细胞活动中具有重要的生理作用。同时，ADAM家族成员还是胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞(ASC)分子网络中关键的调控因子，参与受精卵ESC的整合、分化、裂解，以及肌肉、神经等组织ASC的迁移、分化等过程。另外，ADAM 家族蛋白通过调苄基因表达、调控胞内外环境、激活酶原和解除抑制剂等途径参与恶性肿瘤的发生及演变。在30多种ADAM家族成员中，ADAM15(metargidin)被发现与人类多种实体瘤，如胃癌、肠癌、乳腺癌和前列腺癌等的发生和发展密切相关。作为ADAM家族中唯一一个在去整合素结构域含有RGD (Arg-Gly-Asp)基序的成员，ADAMl5具有典型的药物分子靶点结构与特征，对于抗肿瘤药物的研制具有重要指导意义。然而，由于天然来源的ADAM15蛋白十分有限，如何获得高表达量的重组ADAM15蛋白或其片段，进而深入研究其在肿瘤发生发展中的分子机制已成为肿瘤新型药物开发领域的研究热点。重组蛋白可以在原核生物表达体系和真核细胞表达体系中进行表达生产。对于结构比较简单，蛋白翻译后修饰很少或翻译后修饰对蛋白结构和活性没有影响的蛋白，可以直接采用原核表达体系，如大肠杆菌进行生产表达。这类表达方法具有产量高、成本低的优点。对于结构相对比较复杂，蛋白翻译后修饰很重要的蛋白通常需要采用真核细胞表达系统进行表达生产，但是此类表达系统有蛋白产量低，生产成本高的缺点。真核细胞表达体系包括哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞/杆状病毒表达体系，其中以哺乳动物细胞表达出的蛋白与人的生理状态下蛋白结构最接近、活性最高。常用的哺乳动物细胞表达体系包括瞬时表达体系和稳定表达体系，瞬时表达体系可以米用人HEK293细胞，或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等，其主要方法是将大量的表达载体DNA质粒通过试剂转染进入细胞内进行短时间内的蛋白表达。而稳定表达体系是通过筛选DNA质粒整合到细胞染色体上的稳定表达克隆并建立稳定表达细胞株进行培养表达。常用的稳定表达宿主细胞系有人HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、BHK细胞、SP2/0细胞等。其中，CHO (dhfr-)系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，当携带dhfr基因的表达质粒转染CHO细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，dhfr可被叶酸类似物氨甲喋呤(Amethopterin, MTX)所抑制，不断提高MTX浓度，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系，结果会导致与dhfr串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。目前，重组ADAM15胞外段在sf21昆虫细胞中已有表达，其去整合素结构域蛋白片段在大肠杆菌、毕赤酵母表达系统中也成功表达，重组ADAM15在哺乳动物细胞体内表达还未见有报道，更没有相关文献涉及构建稳定株、生产完整ADAM15胞外段重组蛋白。本专利技术提供了一种可以成功在真核细胞表达体系中高效获得可溶表达的完整ADAM15胞外段蛋白的方法。通过与多聚组氨酸片段融合表达，可以方便地使用镍柱纯化，从而实现商业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可在真核细胞中高效表达的去整合素金属蛋白酶ADAMl5胞外段蛋白的方法。该蛋白为融合表达的蛋白，其具体结构为C端his融合的ADAM15(即ADAMl5h)，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，由该核苷酸编码的氨基酸序列为SEQID NO:2。本专利技术所提供的ADAMl5h，是由pSCT_ADAMl5h转化宿主细胞系后表达得到的ADAMl5h融合蛋白。ADAMl5cDNA是使用人脾脏cDNA文库通过PCR方法制备的。宿主细胞系是动物细胞；优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和/或人胚肾(HEK)细胞；最优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。本专利技术的第二个目的是提供一种制备重组ADAM15h融合蛋白的方法。本专利技术所提供的制备重组ADAMl5h融合蛋白的方法，是用pSCT_ADAMl5h转化宿主细胞系，被转化的宿主细胞系经培养筛选出重组ADAM15h表达克隆，得到重组蛋白ADAMl5h0其中，宿主细胞系是动物细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和/或人胚肾(HEK)细胞。宿主细胞系的培养方法包括悬浮培养、将细胞固定在培养烧瓶或瓶子或生物反应器上培养等。所筛选出的重组蛋白ADAM15h表达克隆是CHO ADAM15h_G8_l I。所述CHOADAM15h-G8-ll是通过在培养基中加入增量氨甲喋吟(MTX)选择得到的。按照本专利技术提供方法生产的ADAM15h，培养上清中可获得10mg/L以上的蛋白产量。本专利技术提供了纯化重组ADAM15h融合蛋白的方法。可以使用Ni柱亲和纯化。本专利技术还提供了对纯化ADAM15h蛋白进行活性检测的方法。即测定该蛋白切割荧光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2能力的方法。 按照本专利技术提供方法得到的ADAM15h可用于研究该家族蛋白的生物功能、作用机理，更可进一步用于抗肿瘤药物的研发。【专利附图】【附图说明】图1.ADAMl5h纯化蛋白的SDS-PAGE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组表达的ADAM15h蛋白，是由pSCT‑ADAM15h转化宿主细胞系后表达得到的融合蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗春霞，杨茜，孙春昀，李成红，胡萍，黄序，
申请(专利权)人：北京义翘神州生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11