用于治疗疾病的腺病毒载体制造技术

本发明专利技术公开了腺病毒载体，包括突变腺病毒，所述腺病毒载体的Ｅ３区域中含有可使该区域，或者其中含有的选择基因部分或全部缺失的限制位点，以及如有必要，取代外源基因的组合物和方法，该外源基因将会表现出在时间的选择和表达程度方面都类似于其所取代的内源腺病毒基因的表达模式，并且进一步可任选地包括该腺病毒基因组中其它部分的突变，包括Ｅ１Ｂ或Ｅ１Ａ区域，所述腺病毒载体可以用于诊断或治疗疾病，优选涉及多余细胞生长的疾病，包括癌症。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及基因治疗领域，更具体地说涉及具有预防或治疗用途的腺病毒载体。
技术介绍
腺病毒是实施基因治疗的一种备选载体。参见，Jolly，D.，癌症的基因治疗(Cancer Gene Therapy)，vol.1，no.1-1994pp5 1-64。腺病毒了解透彻的分子遗传学知识使其成为该领域中的优选载体。腺病毒是无被膜二十面体双链DNA病毒，线性基因组大小约为36 kbp。该病毒基因组的每一端都带有一段称为末端反向重复序列(或ITR)的短序列，这段序列为病毒复制所必需。部分该病毒基因组易于用外源DNA取代，而且重组腺病毒具有稳定的结构。腺病毒复制循环分为两个阶段即早期阶段和晚期阶段，在早期阶段中，El、E2、E3和E4这4个转录单元被表达，晚期阶段发生在病毒DNA合成开始之后，期间晚期转录本在主要晚期启动子(MLP)调控下得以表达。晚期信息编码大部分的病毒结构蛋白质。El、E2和E4的基因产物负责转录活化、细胞转化、病毒DNA复制以及其它病毒功能并且是病毒生长所必需的。迄今为止，多数腺病毒载体是在对病毒进行下述操作的基础上制备而成的突变发生于El、E3或E4上游的位点以提供用于插入外源DNA的位点。可能这类载体中的绝大部分都是以缺失基因组El区域的腺病毒突变株为基础的。通过缺失该区域，使得该病毒复制机能不全，此外得到一个可插入外源基因的区域。有关将腺病毒用于基因治疗已有大量报道。例如，Smith，等人，自然遗传学(Nature Genetics)，Vol.5，pgs.397-402(1993)一文中公开了向小鼠施用包括人因子IX基因的腺病毒载体。这种施用导致有效的肝转导，人因子IX的血浆水平可以有效地治疗乙型血友病患者。但是，注射9周后，人因子IX水平会慢慢地衰减到基线水平，而且这种水平还不能通过第二次载体注射来重建。Smith等人还发现抗腺病毒中和抗体能阻碍腺病毒成功的重复施用。Kozarsky，等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，Vol.269，No.18，pgs.13695-13702 (1994年5月6日)一文中公开了将一种包括编码LDL受体的DNA的腺病毒载体输注到兔中。发现LDL受体基因能够在兔子体内稳定表达7～10天，在3周内减低到不能检测的水平。抗腺病毒中和抗体的生成导致第二剂量的完全失效。Kass-Eisler.等人，基因治疗，Vol.1，pgs.395-402(1994)一文指出，腺病毒载体在成人体内表达的持续时间受到限制与T-细胞应答有关，但并非完全取决于T-细胞应答。该作者进一步指明环孢菌素A不能有效阻断针对该载体的体液应答。Fang，等人，细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)，增刊21 A.C6-109，pg 363(1995)一文公开了向已用免疫抑制剂环孢菌素A处理过的狗中重复注射腺病毒载体的尝试。这种重复注射的尝试未获成功。Yang，等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，Vol.91，pgs.4407-4411(1994年5月)一文中描述了一种其中Ela和F1b区域已缺失的重组腺病毒。这类病毒还包括一种转基因。当将这类腺病毒施用给一种动物宿主时，含有上述重组病毒基因组的细胞可表达目的转基因，但是同时也发生病毒基因的低水平表达。如上例示，腺病毒在体内可以有效地将基因转移到细胞中，因此可以用作送递载体将目的基因导入真核细胞，腺病毒从而通过结合细胞受体将这类基因送递至真核细胞。但是，腺病毒基因转移受到一些因素的限制，这部分来源于宿主对于腺病毒载体颗粒、该载体颗粒的分解产物或者转导细胞的应答。这些宿主应答包括非特异性应答和特异性免疫应答。所述非特异性应答包括炎性和非炎性变化。后者的一个实例是宿主细胞基因表达的变化。特异性免疫应答包括各种细胞应答及体液抗体应答。细胞应答包括辅助T-淋巴细胞、抑制性T-淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤细胞所介导的应答。尽管腺病毒载体介导的基因转移的高效率，但是腺病毒载体介导基因转移的瞬时性表明有必要重复注射腺病毒载体。但是，最近对棉鼠的研究表明直接针对腺病毒载体的宿主免疫应答与基因转移效率的衰减以及重复注射后的表达相关。Yei等人，基因治疗，1192-200(1994)。E3区域编码gp 19K、10.4K、14.5K和14.7K这几种非病毒复制所必需的免疫调节蛋白，以及一种大小为11.6K的蛋白质，这种蛋白质为感染细胞的裂解以及传染性后代的释放所必需。虽然E3区域对于病毒复制并非必不可少，但是其在调控宿主对病毒的免疫应答中发挥关键作用。例如，已知gp 19K能够结合内质网中的MHC I类分子，从而抑制其糖基化以及向病毒转染细胞表面的转运。因此，转染后的细胞不能被细胞毒性淋巴细胞识别为外源物质。参见，Burgert.B.，等人，美国国家科学院院报1987，Vol.81356-60。由于E3区域具有多种功能，所以希望获得一种具有下述特性的腺病毒用于基因治疗根据载体的预期用途缺失E3中的特定部分，而代之以外源的DNA。例如，描述了E3区域中可以去除Xba 1位点之间的1.88Kb片段的缺失。参见Berkner，K.Sharp，P.，(1983)核酸研究(Nucleic Acids Res.)Vol.11.6003-6020页，及Haj-Ahmad，Y.和Graham，F.(1986)病毒学杂志(J.Virol.)Vol.57.267-274页。另外还描述了用于构建在El和E3区域中带有插入片段或缺失的组合物及方法。参见，Ginsberg，H.S.等人，美国国家科学院院报1989，Vol.86，pp.3823-7。因此，尽管现在已有在E3区域突变或该区域大部分缺失的载体，但是迄今为止还没有一种去除了该区域中的选定部分而代之以外源DNA的腺病毒载体。专利技术概述本专利技术的第一个目的为描述具有下述特征的重组腺病毒载体即E3区域中含有可使该区域，或者其中包含的选择基因部分或全部缺失的限制位点，如有必要，代之以外源基因，该外源基因表现出的表达模式在定时和表达程度上都类似于它所取代的内源腺病毒基因。本专利技术的第二个目的为描述在编码6.7K和gp19K蛋白的E3区域的早期区域基因中含有限制位点的重组腺病毒载体。本专利技术的第三个目的为描述在编码10.4k、11.6k、14.5k和14.7k蛋白的E3区域中含有限制位点的重组腺病毒载体。本专利技术的第四个目的为描述具有下述特征的重组腺病毒载体即E3区域中含有可使该区域，或者其中包含的选择基因部分或全部缺失的限制位点，以及用于其中取代以外源DNA的组合物和方法。本专利技术的第五个目的为描述在E3区域中含有可使该区域或者其中包含的选择基因部分或全部缺失的限制位点的重组腺病毒载体的制备方法。本专利技术的第六个目的为描述含有重组腺病毒载体的宿主细胞，所述重组腺病毒载体E3区域或者其中包含的选择基因部分或全部缺失。本专利技术的第七个目的为描述在E3区域中含有可使该区域或者其中包含的选择基因部分或全部缺失的限制位点的重组腺病毒突变体。本专利技术的第八个目的为描述在E3区域中含有可使该区域或者其中包含的选择基因部分或全部缺失的限制位点的重组腺病毒突变体，包括病毒粒体E3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有重组腺病毒载体的物质组合物，所述腺病毒载体在Ｅ３区域中含有可促使Ｅ３区域或其中所含的选择基因部分或全部缺失的限制位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T赫米斯顿，LK豪金斯，L约翰逊，
申请(专利权)人：昂尼克斯药物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]