腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，将hBMP‑2基因以重组缺陷型腺病毒表达载体Ad‑hBMP‑2转染骨髓基质干细胞BMSCs,并将转染后的细胞与同种异体脱钙骨DBM支架材料在体外复合，植入ANFH的动物模型并对所修复股骨头进行X线、透射电镜、组织学、免疫组化分析(半定量)及力学性能的检测。通过本发明专利技术，阐明干细胞的增殖、定向分化及退变的条件及影响因素，为干细胞治疗ANFH提供细胞学理论支持，通过成功论证骨髓间充质干细胞的数量、分化及退变等与股骨头缺血性坏死的关系，为干细胞治疗股骨头缺血性坏死这一理论成果最终向临床过渡提供依据与支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学
，尤其涉及一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法。
技术介绍
最新研究发现，股骨头缺血性坏死(ANFH)病人的骨髓间充质干细胞的活性和数量都出现下降，这提示该疾病的发病原因可能不是成骨细胞本身而是间充质干细胞的增殖或分化受到抑制。而干细胞移植又存在细胞表型变异失去成骨能力现象，股骨头缺血性坏死(avascularnecrosisoffemoralhead，ANFH)是临床上常见的骨科疾病，致残率极高。目前的治疗措施包针对早期病例的髓芯减压、钻孔植骨等,以及晚期病例的股骨头置换术。这些方法效果都不甚满意,且存在争议。近来的研究显示股骨头坏死病人的骨髓中间充质干细胞的活性和数量都出现下降，这表明该疾病的发病原因可能是间充质干细胞的增殖或定向分化受到抑制。因此，利用骨髓间充质干细胞移植将成为未来治疗股骨头缺血性坏死的研究热点。但人们用各种方法从自体红骨髓中提纯的骨髓间充质干细胞很难达到临床应用的细胞数量，且无论是体外培养扩增还是体内移植中发现均存在细胞表型变异问题，即细胞去分化成纤维细胞特征，失去成骨能力，导致细胞数量受到限制，达不到组织构建的要求。本专利技术在广西壮族自治区卫生厅计划项目《TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损》的分析中也发现，单纯的干细胞虽然具有很强的组织修复潜能，但其所修复的组织在3个月左右即出现退变，远期治疗效果不佳。选择合适的细胞生长支架是任何组织构建过程中必须面对的难题，也是本专利技术着力要解决的问题之一。广泛使用选取人骨形态发生蛋白-2作为目的基因，是考虑其具有很强的促成骨细胞增殖、分化的作用。在体外对骨髓间充质干细胞有强烈的成骨转化作用。在众多的骨生长因子中，骨形态发生蛋白2在促进骨缺损修复和骨折愈合过程中效果显著，已成为骨组织工程常用的生长因子。BMP-2位于骨形成过程级联反应的上游，调控胞核内相关基因的表达，诱导细胞的成骨向分化，且成骨过程中间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等又不断合成、分泌BMP，通过正反馈机制不断促进成骨。本专利技术在桂林市科委的资助下对hBMP促进成骨作用在骨质疏松和椎体滑脱治疗的研究中也证实了hBMP-2的良好的成骨诱导活性。广泛使用的各种合成材料，即使进行了表面改性及修饰处理，但在生物学和力学性能上总是不尽人意。这使得近年来人们又将目光投向天然人工骨材料。迄今为止，研究同行在这一命题的研究多限于基因转染细胞的体外成骨效果，而对体内如何控制骨髓间充质干细胞移植到体内后的分化方向及细胞诱导因子的持续有效的释放等方面的研究还很不成熟，这离完整地理解并应用组织工程这一原理来修复病变组织相差甚远。结合国内外同行的研究报道和本专利技术的研究基础，不难推断，如能将使hBMP在整个组织修复过程中持续地对细胞发生作用，使之朝我们需要的组织细胞形态分化，必将把组织工程学理论在股骨头缺血性坏死的研究和治疗向前推进一大步。综上所述，本专利技术拟在股骨头缺血性坏死的研究中，重点研究腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓间充质干细胞与支架材料复合修复股骨头坏死的作用，并对其机理做更加深入的探讨，为这一理论成果最终在临床应用提供理论与实践基础。这一模式应用于临床的前景十分广阔。它将有力地促进我国在该领域的研究在世界上占有一席之地。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，旨在解决基因转染对BMSCs增殖的影响及基因转染的干细胞对ANFH的修复治疗作用和干细胞的增殖、分化及退变过程对ANFH影响，并且目前的细胞生长支架在组织构建过程中存在生物学和力学性能上缺陷的问题。本专利技术是这样实现的，一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，该腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法包括：将hBMP-2基因以重组缺陷型腺病毒表达载体Ad-hBMP-2转染骨髓基质干细胞BMSCs；根据病毒滴度以感染复数(MOI)50、100、200感染兔BMSCs。转染48h后，荧光显微镜下观察，可见感染复数为100转染的细胞，转染效率达95％以上；感染复数为50转染的细胞状态良好，但细胞内出现绿色荧光蛋白相对比较少，转染效率约为60％左右；当感染倍数为200时的感染效率较感染倍数为100时的感染效率无明显增加，荧光显微镜下见EGFP的表达说明Ad-BMP-2/EGFP包装成功。并将转染后的细胞与同种异体脱钙骨DBM支架材料在体外复合；选取脱钙骨基质24块，放入体积分数为15％胎牛血清的DMEM培养液中浸泡12h，无菌滤纸吸干备用。选取BMP-2基因转染48h后的BMSCs与同期对照组细胞接种，细胞悬液充分渗入后放入37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱中贴附4h，再缓慢加入体积分数为15％胎牛血清的DMEM培养液静置培养，隔天换液。培养48h后倒置显微镜、荧光显微镜观察细胞黏附情况，材料与细胞复合培养第7天，取各组部分样品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金后观察。通过扫描电镜观察到细胞与脱钙骨基质材料复合体外培养7天后扫描电镜观察可见脱钙骨表面的细胞粘连成片，细胞布满孔隙，呈伸展状、立体状生长。植入ANFH的动物模型并对所修复股骨头进行X线、透射电镜、组织学、免疫组化分析(半定量)及力学性能的检测。X线检测：术后第4、8、12周，所有实验动物在全麻下拍摄双髋关节正位片，X线片拍摄在放射科完成，拍摄条件为45kV、125mA，投照距离为100cm，曝光时间为32ms，其结果示：A组术后4w时，实验侧股骨头钻孔清晰可见，边缘锐利，骨缺损区呈现低密度影，部分标本出现了小囊性变，股骨头轮廓欠规则，扁平塌陷，密度不均；术后8w时，低密度透光区仍然清晰可见，缺损区周围有骨吸收现象，股骨头关节面进一步塌陷，且骨小梁结构不清晰；12w时股缺损区仍然透亮，股骨头外形缩小，缺损严重，完全塌陷，B组术后4w时，股骨头骨密度降低，缺损区仍然存在，填充材料呈高密度影，未见明显吸收，周围见明显透光区，股骨头无塌陷；术后8w时，股骨头形态仍正常，填充材料周围透光区仍清晰，钻孔区密度高而均匀，钻孔边缘出现放射状骨小梁接合现象，但骨小梁结构比较紊乱；12w股骨头缺损区仍然存在，填充材料呈高密度影，体积较前略变小，与周围边界模糊，缺损区可见少许成骨反应及松散骨小梁结构，C组4、8、12w变化与B组大致相同，D组术后4w时，人工骨影模糊，钻孔区有密度增高影，质地均匀，钻孔边缘变得模糊；术后8w时，人工骨影缩小，边界不清，周围透光区影模糊；12w股骨头内出现规则连续骨小梁，钻孔边缘与人工骨交界区骨小梁接合很好，界限模糊，看不到骨缺损的低密度影，钻孔区骨密度接近周围骨质，未出现股骨头塌陷和关节间隙狭窄等骨性关节炎表现；Lane-SandhuX线评分整理各组动物X线检查结果，参照Lane-SandhuX线评分标准对各组股骨头修复情况进行评分；HE染色和镜检测：取出股骨头标本和一块正常股骨头，沿转子间连线锯断股骨头，行HE染色，其步骤如下：①股骨头标本用4％多聚甲醛固定5天。②用蒸馏水将固定标本冲洗3次，然后沿转子间连线锯断，投入体积分数10％硝酸溶液中进行脱钙5天。③用梯度酒精脱水：体积分数60％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，其特征在于，该腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法包括：将hBMP‑2基因以重组缺陷型腺病毒表达载体Ad‑hBMP‑2转染骨髓基质干细胞BMSCs；并将转染后的细胞与同种异体脱钙骨DBM支架材料在体外复合；植入ANFH的动物模型并对所修复股骨头进行X线、透射电镜、组织学、免疫组化分析及力学性能的检测。

【技术特征摘要】
1.一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，其特征在于，该腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法包括：将hBMP-2基因以重组缺陷型腺病毒表达载体Ad-hBMP-2转染骨髓基质干细胞BMSCs；并将转染后的细胞与同种异体脱钙骨DBM支架材料在体外复合；植入ANFH的动物模型并对所修复股骨头进行X线、透射电镜、组织学、免疫组化分析及力学性能的检测。2.如权利要求1所述的腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，其特征在于，所述同种异体脱钙骨DBM支架材料为在体外构建具有生物活性的载体-细胞因子基因转染干细胞复合物，该同种异体脱钙骨DBM支架材料制备方法为：健康新西兰大白兔处死后取其四肢骨干骺端骨及椎体松质骨，根据Urist等方法经-80℃低温冻存72h，剔除骨组织以外组织，脱钙液脱钙72h，置乙醚、乙醇中脱脂各24h，以无菌蒸馏水反复冲洗、浸泡，直至浸泡液呈中性为止；去酸处理后的骨块继续在蒸馏水中浸泡24h，取出后自然晾干,制成4mm×4mm×3mm脱钙骨基质,环氧乙烷消毒，4℃保存备用；倒置显微镜下观察支架材料的孔隙结构，取部分样品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，进行喷金；通过扫描电镜扫描脱钙骨基质材料表面。3.如权利要求2所述的腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，其特征在于，所述同种异体脱钙骨DBM支架材料为具有天然网状孔隙系统的原骨盐支架三维结构。4.如权利要求1所述的腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，其特征在于，所述将hBMP-2基因以重组缺陷型腺病毒表达载体Ad-hBMP-2转染骨髓基质干细胞BMSCs，具体为：根据病毒滴度以感染复数MOI50、100、200感染兔BMSCs；转染48h后，观察感染复数为100、感染复数为50、感染复数为200的转染细胞的转染效率。5.如权利要求1所述的腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，其特征在于，所述并将转染后的细胞与同种异体脱钙骨DBM支架材料在体外复合，具体为：选取脱钙骨基质24块，放入体积分数为15％胎牛血清的DMEM培养液中浸泡12h，无菌滤纸吸干备用；选取BMP-2基因转染48h后的BMSCs与同期对照组细胞接种，细胞悬液充分渗入后放入37℃、5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，赵美玉，李诗鹏，茹嘉，武成聪，陈佳滨，宁寅宽，蔡伟良，石正松，
申请(专利权)人：桂林医学院，
类型：发明
国别省市：广西;45