一种新型衣壳蛋白基因修饰腺病毒载体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，涉及一种新型衣壳蛋白修饰的重组腺病毒载体。具体涉及到一种不影响包装、对人体正常细胞无毒害作用、并且对肿瘤或癌症细胞具有特异性高杀伤力的靶向性腺病毒载体及其用途。

【技术实现步骤摘要】


技术介绍
溶瘤病毒(Oncolytic Viruses)作为一种极具潜力的生物抗肿瘤手段目前已引起人们的广泛关注。经过基因改造的病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，破坏并溶解细胞，释放出的子代病毒又能感染邻近的肿瘤细胞，产生级联效应，而正常组织细胞在此过程中不受病毒影响[1]。另外，病毒破坏肿瘤细胞的同时会释放细胞因子和肿瘤抗原，改变肿瘤微环境甚至激活全身免疫。目前，多种人类病毒可通过分子生物学手段改造成具有溶瘤活性的条件复制型病毒即溶瘤病毒，包括腺病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和麻疹病毒等[2-5]。其中，溶瘤腺病毒由于具有感染宿主广、安全易生产、可插入较大外源基因等优点而受到广泛的研究和应用。结合基因治疗和溶瘤病毒治疗的双重优势，以溶瘤腺病毒为载体介导的基因治疗是一种十分具有应用前景的恶性肿瘤治疗策略。目前已开展的溶瘤腺病毒或携带抗癌基因的溶瘤腺病毒制品临床研究很多，包括Onyx-015、SG500、CG7060、Ad5-D24-RGD等[2]。国内对于溶瘤腺病毒的研究起步较早且一直处于国际先进水平。2005年，国家食品药品监督管理局(SFDA)批准了世界上首个溶瘤腺病毒产品H101(安柯瑞)用于肿瘤患者的治疗，极大地推动了国内外溶瘤腺病毒的临床转化应用研究[6]。刘新垣院士团队提出的“癌症的靶向基因-病毒治疗”策略是溶瘤腺病毒研究和应用的一大创新和突破，其原理是通过溶瘤腺病毒ZD55表达插入的外源抗癌基因来增强其抗癌作用。在此基础上，他们又提出“癌症的靶向双基因-病毒治疗(targeting dual gene-virotherapy of cancer，CTGVT-DG)”，即在ZD55中插入两个肿瘤治疗基因，两个基因可通过不同机制产生协同效应或互补作用，因此能够增强其抗癌功能[7,8]。此外，他们还针对不同器官癌症如肝癌、肠癌等，利用组织特异性启动子开展个性化治疗的尝试，也取得了较好的治疗效果[9,10]。尽管溶瘤腺病毒构建策略日趋成熟，然而如何突破腺病毒载体人体应用的限制，保证病毒安全性的基础上进一步提高有效性仍是研究者追求的方向。另外，溶瘤病毒的传统给药途径是瘤内注射，局部药物浓度很高，但扩散受限，对于较大肿瘤需要多部位注射，增加操作次数，且分布不均。而大多数恶性肿瘤手术或放疗后复发都是多中心的，所以瘤体内直接注射病毒并不适宜。溶瘤腺病毒的全身给药目前还未被广泛接受，主要是由于这种给药方式的溶瘤腺病毒能否到达瘤体的原发部位及转移灶，并在肿瘤内有效的复制再感染尚未有定论。因此，目前在该领域仍然需要通过基因工程技术进一步改造腺病毒载体，使其成为新一代增 强型溶瘤腺病毒基因治疗载体。本专利技术就是为了满足此种需求并提供相关优点，以有利于肿瘤的基因治疗，实现肿瘤靶向、减轻肝毒性以及增强其抗肿瘤效应的目的，对于溶瘤腺病毒载体的进一步应用具有重要意义。本专利技术的目的是利用肿瘤坏死因子诱导凋亡配体(TRAIL)重组蛋白和基于TRAIL的基因治疗均具有较强抗肿瘤活性的特点，设计构建以TRAIL修饰病毒衣壳蛋白的新型溶瘤腺病毒基因治疗载体，可在调控病毒载体感染性质、组织分布的同时增强其特异性抗肿瘤效应。根据腺病毒衣壳蛋白的结构和功能特征，以往对于腺病毒衣壳蛋白的基因修饰主要是在六邻体、纤维蛋白以及pⅨ上。考虑到结构修饰对病毒包装的影响，我们基于pⅨ设计了一种全新的改造策略。pⅨ是唯一一个暴露于腺病毒衣壳外表面的次要衣壳蛋白，在病毒衣壳上有240个拷贝。结构分析显示，每3个pⅨ单体的N末端形成三曲臂型结构将3个六邻体粘合在一起，而C末端形成反平行的四聚体位于两个六邻体对应面的边缘[11]。研究表明，短肽甚至一些较长肽段可通过与pⅨ的C末端结构域融合修饰到腺病毒的衣壳表面，并且不影响病毒的包装和复制。利用一些柔性Linker，可将一些较大的蛋白如GFP、单链抗体、单区抗体等修饰到病毒的衣壳表面，从而标记病毒或使其具有靶向的感染能力[12]。而在另一项研究中，Glasgow等利用一种亮氨酸拉链异二聚体(Leucine Zipper Heterodimers)可将单链抗体分子修饰到腺病毒的纤维蛋白[13]。综合这些研究，我们的设计就是利用这种亮氨酸拉链异二聚体系统，将其中一个单链Zipper融合到pⅨ的C末端，而将与其配对的Zipper融合到溶瘤腺病毒表达TRAIL的N末端，这样载体分泌表达的TRAIL将通Zipper配对修饰到完成装配出细胞的病毒的衣壳表面。该载体的特点是仅以短肽修饰pⅨ，因此不会影响病毒的包装，载体表达的TRAIL除直接诱导肿瘤细胞凋亡外，还将修饰到子代病毒的衣壳蛋白表面，在改变腺病毒载体靶向性等性质的同时增加了自身稳定性从而使载体获得了更强的肿瘤抑制活性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新型的衣壳蛋白基因修饰腺病毒载体，其特点是病毒的衣壳蛋白表面连接了TRAIL蛋白。该载体是通过基因工程技术对衣壳蛋白pⅨ进行基因修饰，同时可表达融合亮氨酸拉链的TRAIL蛋白，表达的TRAIL融合蛋白可通过亮氨酸拉链异二聚体系统自组装至病毒的衣壳表面。本专利技术提供的新型重组腺病毒载体，其表达的TRAIL融合蛋白以及连接至病毒表面的TRAIL蛋白均具有肿瘤细胞凋亡活性。同时该载体通过静脉注射时在小鼠体内具有明显的降低肝富集和肿瘤细胞靶向能力。本专利技术提供的新型重组腺病毒载体还进一步构建了溶瘤腺病毒载体，该溶瘤腺病毒载体的靶向性和抗肿瘤活性优于复制缺陷型腺病毒载体和未改造的溶瘤腺病毒。本专利技术还提供了本专利技术的重组腺病毒载体用于制备肿瘤治疗药物的用途。本专利技术提供的载体既赋予了其肿瘤靶向能力及潜在的静脉给药能力，又显著增强了抗肿瘤活性。附图说明图1.新型衣壳蛋白基因修饰腺病毒载体设计原理示意图。图2.新型腺病毒载体基因组示意图。图3.新型腺病毒载体基因组PCR鉴定电泳图，条带1：rAd5-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a，条带2：rAd5pz-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a，+/-：阳性、阴性对照。图4.流式细胞技术检测新型腺病毒载体的肿瘤细胞凋亡作用。图5.新型腺病毒载体体外抗肿瘤活性检测。图6.新型腺病毒载体静脉注射后肿瘤靶向检测，组织编号1-6分别为：心脏、肝脏、脾、肺、肾脏、肿瘤。图7.新型腺病毒载体小鼠体内肿瘤抑制实验流程图图8.新型腺病毒载体抑制荷瘤鼠肿瘤细胞生长情况检测，A0-4：rAd5-RFP、rAd5-zTRAIL-RFP、rAd5pz-zTRAIL-RFP、rAd5-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a和rAd5pz-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a。具体实施方式实施例1新型腺病毒载体骨架质粒和穿梭质粒的构建1、骨架质粒的构建经过基因查找，我们发现在腺病毒载体基因组上，在pIX基因内部和下游，分别有一个SmaI(TAKARA公司)酶切位点。所以我们利用SmaI内切酶将R·R34基因融合到pIX的C末端。首先，采用生物合成技术获得SmaI-pIX-(G4S)3-R·R34-SmaI这段基因，然后使用SmaI工具酶将合成的基因片段回连到pIX基因上。PCR的反应体系(50ul)：灭菌水：34.5ul10×buffer：5ulMgSO4(25mM):2uldNTP(2mM)：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒载体，其特征在于腺病毒衣壳蛋白表面连接了TRAIL蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种重组腺病毒载体，其特征在于腺病毒衣壳蛋白表面连接了TRAIL蛋白。2.权利要求1所述的重组腺病毒载体，其中所述的腺病毒衍生自人腺病毒、禽腺病毒和猴、马、牛、羊、猪、狗、鼠等哺乳类动物腺病毒。3.权利要求2所述的重组腺病毒载体，其中所述腺病毒进一步衍生自人血清5型腺病毒。4.权利要求1所述的重组腺病毒载体，其中连接TRAIL蛋白的病毒衣壳蛋白选自六邻体、五邻体、纤维蛋白和pIX。5.权利要求4所述的重组腺病毒载体，其中连接TRAIL蛋白的病毒衣壳...

【专利技术属性】
技术研发人员：于彬，于湘晖，孔维，王真，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22