本发明专利技术涉及一种利用重组腺相关病毒载体的基因治疗药物rAAV9-KAL，实验研究结果表明，所述基因药物不仅可以治疗移植性肺癌，也可以用于原位肺癌以及肝癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤；不仅适用于rAAV9型载体，也适用于其他血清型载体rAAV1-rAAV8和rAAV10-rAAV12；不仅适用于单链rAAV载体，也适用于双链rAAV载体。
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术涉及一种利用重组腺相关病毒载体的基因治疗药物。
技术介绍
:目前在我国，肺癌是危害人民健康的恶性肿瘤之一，标准化放、化疗治疗的肺癌患者，平均生存期为28.7个月，是威胁病人生命的头号杀手！随着生物技术的不断发展，基因药物逐渐成为人们关注的一种新治疗手段。所说基因药物，是指利用基因序列数据，经生物信息学分析、高通量基因表达、高通量功能筛选和体内外药效学研究开发得到新药候选物。Kallistatin(KAL)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,能特异性与血衆型激肽释放酶结合而不与组织型激肽释放酶结合的蛋白，存在于多种组织和体液中，是人体内源性血管生长抑制因子，具有抗炎、抗氧化、抗高血压、抗肿瘤等作用。目前，多个实验室开展了 KAL的抗肿瘤实验研究，涉及的肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌和肺癌等。虽然已有报道称，利用kallistatin蛋白或者含有kallistatin基因的质粒针对肺部肿瘤的治疗,不过,存在半衰期较短、需要短期内高剂量持续给药等问题困惑，因此迫切需要寻找一种肺癌靶向的、能长效表达的载体，用于携带kallistatin基因，更好地发挥治疗肺癌的作用。为了更好地解决上述问题，本实验室选用了具有广泛宿主范围、能够介导外源基因长期表达、安全性能好、在人类没有致病性、可以转染分裂或者非分裂的哺乳动物细胞并有肺部靶向的9型重组腺相关病毒载体(rAAV9) 。本专利技术所述将rAAV9载体携带kallistatin的cDNA，腹腔注射到人肺癌荷瘤鼠体内，以PBS为阴性对照，以顺钼为阳性对照，观察49天，发现rAAV9-KAL能明显抑制肿瘤的增殖。本专利技术提供的治疗肺癌基因药物rAAV9-KAL，迄今尚未见有国内外的相关报道。
技术实现思路
:本专利技术提供的肺癌治疗基因药物(rAAV9_KAL)，包括以下步骤:(I)基因重组质粒是含kallistatin的cDNA基因，基因表达框两端为AAV2血清型的末端反向重复序列(inverted ter min al repeat, ITR)、牛生长激素poly A兀件(bovine growth hormone polyadenylat1n signal, BGH poly A),其中还含有氨节青霉素选择元件AMP, 土拨鼠肝炎转录后调控元素WPRE(Woodchuck hepatitisPost-transcript1nal Regulatory Element)增强子，CAG chicken β-actin promoter 启动子。载体质粒是血清型AAV2的基因，AAV9的cap基因。(2)三质粒磷酸钙转染法生产rAAV9-KAL，采用CHT色谱联合ANX色谱进行纯化。(3)建立肺癌荷瘤鼠模型，采用腹腔注射形式进行给药，每周观察记录肿瘤大小，7周后通过肿瘤体积,重量以及kallistatin蛋白表达情况，评价rAAV9_KAL的抗肿瘤效果。其中:所述肺癌治疗用rAAV9-KAL剂量，选自I X 102VG/mL到I X 1016VG/mL的任意一个；给药途径适用腹腔注射、静脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、口服等。本专利技术所述的rAAV基因药物，不仅可以治疗移植性肺癌，也可以用于原位肺癌。本专利技术所述的rAAV基因药物，可以用于肝癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤。本专利技术所述的rAAV基因药物，不仅适用于rAAV9型载体，也适用于其他血清型载体 rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12坐寸ο本专利技术所述的rAAV基因药物，不仅适用于单链rAAV载体，也适用于双链rAAV载体。【附图说明】:图1.不同血清型rAAV-KAL的体外抗肿瘤作用图2.不同给药途径的kallistatin蛋白表达量图3.不同血清型rAAV-KAL对皮下移植肿瘤作用图4.单双链rAAV-KAL抗肿瘤作用图5.不同剂量rAAV9_KAL的抗肿瘤作用图6.KAL蛋白在各个器官的表达分布情况图7.肺和肿瘤组织KAL的免疫组化染色图8.组织HE染色图9.小鼠血清生化分析实施方案:以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。《实施例1》体外抗肿瘤试验胰酶消化汇合度为60%-70%的细胞，每孔加入10yL 5X 14个/mL细胞于96孔板，同时以10yL的空白培养基做为空白对照；12h后，细胞贴壁，按照MOI = 10000加入 rAAVl-KAL、rAAV2_KAL、rAAV5_KAL、rAAV6_KAL、rAAV8_KAL 和 rAAV9_KAL 进行感染，48h后测定；每孔加入1ul的CCK-8溶液；在细胞培养箱内继续孵育Ih后在450n m测定吸光度值。按照细胞增殖率(％) = (1-试验组0D450/对照组0D450)X100%，计算肿瘤细胞增殖抑制率。从数据分析可知，几种rAAV载体均能有效转染H446细胞，其中2，5,9型抑制作用较好(见图1A)。《实施例2》KAL蛋白的体外表达试验胰酶消化汇合度为60%-70%的细胞，每孔加入10yL I X 15个/mL细胞于96孔板，同时以10yL的空白培养基做为空白对照；12h后，细胞贴壁，按照MOI = 10000加入 rAAVl-KAL、rAAV2_KAL、rAAV5_KAL、rAAV6_KAL、rAAV8_KAL 和 rAAV9_KAL 进行感染，3 个复孔，培养72h，收集细胞培养上清，采用ELISA方法，测定细胞上清液中的KAL蛋白表达情况。所有的血清型载体均能转染H446细胞，但是，从KAL蛋白表达量看，rAAV2和rAAV9的效果最好(见图1B)。《实施例3》体内给药途径试验7-8周的清洁级Km小鼠，适应性生长7天后，随机分成5组，每组3只，分别为:正常组(Normal),静脉注射组(intravenous inject1n, 1.V.),腹腔注射组(intraperitoneal inject1n, 1.P.),肌肉注身寸组(intramuscular inject1n, 1.Μ.)和皮下注射组(Intracutaneous inject1n, 1.C.)。按照 5 X 111VG/ 只给药，每只 100 μ L,分别在当天、ld、3d之后，每周尾静脉取血，7周后眼眶取血脱臼处死，测定血清中KAL蛋白表达情况。数据结果显示，不同给药途径，KAL蛋白的表达量不同，在1-1Sd的蛋白表达量上比较，1.V.>1.P.>1.Μ>1.H.(图2A)。其中，腹腔注射给药的载体蛋白表达效率是静脉给药的80%左右，蛋白表达趋势是一致的(图2B)。《实施例4》人肺癌裸鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤试验(I)培养的H446人肺癌细胞当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肺癌靶向的基因药物，其特征是，所述基因药物为携带kallistatin的cDNA的9型重组腺相关病毒载体rAAV9‑KAL，基因重组质粒是含kallistatin的cDNA基因，基因表达框两端为AAV2血清型的末端反向重复序列(inverted ter min al repeat，ITR)、牛生长激素poly A元件(bovine growthhormone polyadenylation signal，BGH poly A)，其中还含有氨苄青霉素选择元件AMP、土拨鼠肝炎转录后调控元素(Woodchuck hepatitis Post‑transcriptional Regulatory Element)增强子WPRE，CAG chicken β‑actin promoter启动子载体质粒是血清型AAV2的rep基因，AAV9的cap基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，曲伟红，崔秀灵，
申请(专利权)人：许瑞安，
类型：发明
国别省市：福建;35
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