一种自我清除型腺病毒载体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种自我清除型腺病毒，基于AdEasyTM腺病毒载体系统进行改造，所用穿梭质粒为pShuttle-CMV，其特征在于：所述改造是指在穿梭质粒pShuttle-CMV插入rtetR-VP16基因序列、TRE-PminCMV-Cre基因序列及两个同向的LoxP位点。本发明专利技术可随时诱导腺病毒降解死亡，在组织工程所需种子细胞应用于体内前消除外源基因和腺病毒载体本身；可大幅度降低腺病毒进入机体的数量，从而减轻载体本身对机体的影响，为组织工程产品提供更为安全可靠的载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种自我清除型腺病毒及其制备方法。
技术介绍
外源基因导入技术是组织工程领域里的常用技术。研究者们常使用该技术将编码骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)2、4、7等的基因导入骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stem Cells，BMCs)、脂肪干细胞，用于修复骨缺损；将编码血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)的基因导入骨髓间充质干细胞，用于血管重建；以及携带siRNA以敲低宿主细胞自身基因的表达等。这些研究均取得了不错的效果。 腺病毒载体是外源基因导入过程中使用的主要载体之一，但是，腺病毒载体本身也会带来许多问题，这些问题迄今为止还未得到很好的解决，其中最难于解决的是：在感染293细胞或其他体细胞后，能重新获得E1区编码基因而产生复制型腺病毒(Replication competent adenovirus，RCAs)。该问题在第一代腺病毒上最为突出；第二代腺病毒虽然在第一代的基础上去除了E2a和/或E4区编码基因，也仅仅是使该问题得到了一定的改善，但仍未能彻底解决；第三代腺病毒则仅保留了腺病毒基因组两端的未端重复序列ITRs和5’端的包装序列，理论上来说，第三代腺病毒的这一改进可彻底杜绝RCAs的产生；但在实际应用中，第三代腺病毒的制备流程非常复杂，且必须借助于辅助病毒才能够完成，由此引出了令人头疼的辅助病毒污染问题。 最近发展起来的外源基因表达精确调控技术，由于能使腺病毒的用量得以降低，故在一定程度上缓解了RCAs问题。这些技术包括：在腺病毒上插入药物诱导性启动子，以实现时间上的可控；插入脏器特异性启动子，以实现空间上的可控；或将两种方法相结合，以实现时间、空间上的双重可控；在E1a编码区前面插入脏器特异性microRNA配体，以实现脏器特异性不复制等。这一类研究的主要目的是精确调控外源基因的表达，并没有着眼于解决载体本身的问题，只是使这些问题得到一定程度的缓解。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以实现自我清除的新型腺病毒载体。 本专利技术的目的是通过以下措施实现的： 一种自我清除型腺病毒，基于AdEasyTM腺病毒载体系统进行改造，所用穿梭质粒为pShuttle-CMV，其特征在于：所述改造是指在穿梭质粒pShuttle-CMV插入rtetR-VP16基因序列、TRE-PminCMV-Cre基因序列及两个同向的LoxP位点。其中，rtetR-VP16由反式四环素阻遏蛋白(reverse TetR，rTetR)和单纯疱疹病毒VP16蛋白的基因组成，rtetR-VP16的表达产物为融合蛋白rtTA，rtTA在四环素(或其衍生物，如Doxycycline，Dox)存在的情况下，能与响应元件TRE结合；TRE-PminCMV-Cre由TRE、PminCMV和Cre酶基因三部分组成，TRE是四环素响应元件(Tetracyclin response element)，PminCMV是最小巨细胞病毒启动子，TRE被激活后，能启动Cre酶的表达，而Cre酶则能识别、结合LoxP序列；LoxP由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列组成，当两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同时，Cre重组酶能切除两个LoxP位点间的序列。 本专利技术所述自我清除型腺病毒具有以下特性：在无诱导剂条件下，虽表达反式作用因子rtTA，但rtTA不能与TRE结合，Cre酶基因不转录；当在培养基中加入诱导剂四环素或Dox后，rtTA与TRE结合，启动Cre的转录表达，Cre酶特异性地识别预先植入在穿梭质粒pShuttle中的两个LoxP序列，使得两个Loxp之间的分隔区发生联会重组，位点间的DNA片断被环化切除；腺病毒因其基因组的完整性受到破坏而死亡。此时，原来作为腺病毒标记的绿色荧光蛋白的表达也将终止，在荧光显微镜下可以观察到诱导前表达荧光的细胞失去荧光。 上述rtetR-VP16序列、TRE-PminCMV-Cre序列及两个LoxP位点分别插入穿梭质粒pShuttle的kpnI、XhoI及PemI和EcoRV位点。所述两个LoxP序列分别植入穿梭质粒pShuttle的982bp的EcoRV位点和3516bp的PemI位点，二者之间的序列共长2534bp，并包含了穿梭质粒的右臂基因组(1243bp-3497bp)，该部分为腺病毒存活的关键基因组，删除该部分基因组后，腺病毒不能存活。 在本专利技术中，LoxP位点的选择相当关键：1、两个LoxP位点相隔太远则删除效率过低，相隔太近则不能删除足够长的基因，均不能令腺病毒死亡，而对于具体删除片段位置及长度，既没有经验可借鉴，也没有文献可参考；2、插入LoxP的酶切位点必须是单酶切位点，且为粘头末端以保证两个LoxP序列同向；3、插入LoxP后，腺病毒的存活、复制和装载外源基因的能力不受影响。本专利技术所述的腺病毒不仅解决了上述关键技术问题，而且在酶切时能得到确定的片段，还有效避免了在同源重组、包装及感染HEK293细胞后，不能表达绿色荧光蛋白的问题。 上述pShuttle-CMV序列如SEQ ID NO.1所示，rtetR-VP16序列如SEQ ID NO.2所示，TRE-PminCMV-Cre序列如SEQ ID NO.3所示，两个LoxP位点序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。 上述腺病毒的制备方法，包括以下步骤： (1)在pShuttle穿梭质粒上插入Tet-On系统的rtetR-VP16和TRE-PminCMV-Cre基因；并在其上的PemI和EcoRI位点插入Cre-Loxp系统的两个LoxP位点；得到重组穿梭质粒pShuttleN； (2)骨架质粒和重组穿梭质粒同源重组，包装，收集腺病毒颗粒。 采用上述腺病毒进行自我清除的方法，包括以下步骤：在组织工程所需种子细胞感染上述自我清除型腺病毒48h后，一次性加入诱导剂Dox，使培养基内Dox终浓度为10umol/L。在Dox作用下，新型腺病毒载体可自我清除，5天后外源蛋白的mRNA和蛋白水平降至诱导前的10％至20％(据外源蛋白不同，降解效率不同)，可进行移植。 有益效果...

【技术保护点】
一种自我清除型腺病毒，基于AdEasyTM腺病毒载体系统进行改造，所用穿梭质粒为pShuttle‑CMV，其特征在于：所述改造是指在穿梭质粒pShuttle‑CMV插入rtetR‑VP16基因序列、TRE‑PminCMV‑Cre基因序列及两个同向的LoxP位点。

【技术特征摘要】
2014.06.24 CN 201410266946.21.一种自我清除型腺病毒，基于AdEasyTM腺病毒载体系统进行改造，所用穿
梭质粒为pShuttle-CMV，其特征在于：所述改造是指在穿梭质粒pShuttle-CMV
插入rtetR-VP16基因序列、TRE-PminCMV-Cre基因序列及两个同向的LoxP位
点。
2.如权利要求1所述的自我清除型腺病毒，rtetR-VP16序列插入穿梭质粒
pShuttle-CMV的多克隆位点中的kpnI酶切位点，TRE-PminCMV-Cre序列插入
穿梭质粒pShuttle的多克隆位点中的XhoI酶切位点，两个LoxP位点分别插
入PemI和多克隆位点中的EcoRV酶切位点。
3.如权利要求1或2所述的自我清除型腺病毒，rtetR-VP16序列如SEQ ID NO.2
所示，TRE-PminCMV-Cre...

【专利技术属性】
技术研发人员：李元朝，何威，王儒鹏，周春丽，张斌，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第二附属医院，李元朝，
类型：发明
国别省市：重庆;85