一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种以人3型腺病毒(HAdv3)为载体的新型肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株及其制备方法。人3型腺病毒六邻体上嵌入了两种EV71的中和表位，并在其基因组E3区插入了EV71的VP1蛋白表达框。该疫苗候选株可以诱导强烈的抗EV71感染和抗HAdv3感染的免疫反应，利用该疫苗候选株可制备预防EV71感染和HAdv3感染的双价疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种以人3型腺病毒(HAdv3)为载体的新型肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株及其制备方法。人3型腺病毒六邻体上嵌入了两种EV71的中和表位，并在其基因组E3区插入了EV71的VP1蛋白表达框。该疫苗候选株可以诱导强烈的抗EV71感染和抗HAdv3感染的免疫反应，利用该疫苗候选株可制备预防EV71感染和HAdv3感染的双价疫苗。【专利说明】一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用
本专利技术属于重组病毒基因工程
，具体涉及一种以人3型腺病毒(HAdv3)为载体的新型肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株及其制备方法。
技术介绍
肠道病毒71 型(EV71)是引起手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原体之一，并常导致如无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹及神经源性肺水肿等严重的中枢神经系统并发症，并引起死亡。1969年首次报道全球爆发EV71感染，近年来，EV71爆发流行的报道增多，流行程度呈明显上升趋势，已经成为亚太地区包括国内威胁公众健康的重要病原体。EV71经空气飞沫等途径传播，具高致病性，相对死亡率较高，目前没有有效的治疗药物和方法，疫苗接种无疑是预防EV71病毒感染的最佳途径。EV71属小RNA病毒科肠道病毒属，无包膜的单股正链RNA病毒，其衣壳由4种蛋白质组成:VP1、VP2、VP3和VP4。其中VP1、VP2、VP3在病毒粒子表面，而VP4在病毒粒子内部。有关EV71亚单位疫苗的研究已经显示，VPl由297个氨基酸组成，是衣壳蛋白中有着最大和最多的表面暴露的蛋白，包含了 EV71病毒主要的中和性抗原表位，能刺激机体产生高滴度的保护性中和抗体，是制备EV71亚单位疫苗的最重要的蛋白。目前还没有临床应用的EV71疫苗。表位疫苗是用基于抗原表位制备的疫苗，是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。抗原表位是抗原分子中决定抗原特异性的序列，又称抗原决定簇，包括T细胞表位和B细胞表位，分别是T细胞抗原受体和B细胞抗原受体及抗体特异结合的基本单位。相较传统的疫苗，表位疫苗去除了不需要的甚至有害的抗原和表位而使免疫应答精确针对特定的表位。近年来已经有很多独特的表位已经被鉴定出来并应用于传染病、癌症和自身免疫性疾病的疫苗研究。然而单独的表位肽免疫原性弱，不能诱导免疫应答和免疫记忆，因而近年来发展了很多方法，如新型佐剂、脂肽偶联、应用通用T细胞表位、多抗原肽、纳米呈递系统及病毒载体等，促进了表位疫苗的发展。目前已经发现EV71病毒的多个中和性抗原表位，如VPl蛋白的163-177位氨基酸(PESRESLAWQTATNPC，SP55)和208-222位氨基酸(YPTFGEHKQEKDLEYC, SP70)。腺病毒载体可以有效诱导体液和细胞免疫应答，已经广泛应用于癌症和感染性疾病的基因治疗和疫苗研究中。腺病毒分子量大，其本身是一种极好的免疫佐剂，能有效地刺激机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫；而且腺病毒载体具有容易进行基因操作、容易生产和高产量、高安全性 的特点。传统的腺病毒载体疫苗是作为转基因载体，利用宿主细胞表达外源抗原，刺激机体产生抗原特异的体液或细胞免疫应答。由于人群中普遍存在针对人5型腺病毒载体的预存免疫，以及腺病毒载体的强免疫原性，导致免疫系统对载体的清除作用，抑制了转基因抗原的表达，使传统的腺病毒载体作为疫苗载体的应用受到很大的限制。近年来，采用“抗原展示”策略制备的重组腺病毒疫苗得到发展，即在不影响病毒的感染性及稳定性的前提下，在腺病毒载体衣壳中嵌入外源性抗原从而获得具有新的抗原特性的重组腺病毒粒子。目的抗原肽插入衣壳后作为病毒壳体的一部分，将能多次免疫机体诱导有效的免疫应答，而不需要进行转基因表达，克服了传统的腺病毒转基因载体受机体抗载体免疫限制的缺点。腺病毒颗粒是一个二十面体的对称结构，壳体由12个位于顶角的五邻体基座和纤维蛋白，240个非顶角颗粒的六邻体(hexon)以及结构辅助蛋白多肽构成。六邻体是三聚体结构，是腺病毒颗粒中最丰富的免疫原，在六邻体蛋白中插入一个外源抗原表位，则每个腺病毒粒子就可以展示720个抗原表位，抗原表位可得以充分表达。不同型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序列有高达78-95%的同源性，其区别主要集中在7个高变区(HVRs)，这些高变区暴露于病毒壳体表面，不涉及六邻体单体间的相互作用，也不与其它的腺病毒蛋白相互作用。已有多个基于5型腺病毒的研究表明六邻体的多个高变区具有足够的柔韧性，可以嵌入不同长度的外源肽而不影响病毒的复制、稳定性和功能；而且表位嵌合入某些特定的HVR区的腺病毒载体有可能能够在体内和体外逃避预存的腺病毒免疫，提供更强的免疫原性。因此，衣壳展示EV71中和表位，同时转基因表达EV71的主要抗原VPl蛋白，并保留人3型腺病毒主要抗原的肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株有望用于同时预防EV71感染和HAdv3感染。
技术实现思路
本专利技术提供一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用。本专利技术提供了一种重组人3型腺病毒，所述重组人3型腺病毒基因组E3区插入了 EV71的VPl蛋白表达框，所述人3型腺病毒六邻体中嵌入了两种EV71中和表位SP70和SP55，所述EV71中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述中和表位SP55的氨基酸序列为PESRESLAWQTAT NPC。所述EV71中和表位SP70的替换区为HAdv3六邻体的HVRl区，所述EV71中和表位SP55的替换区为HAdv3六邻体的HVR2区。所述EV71中和表位SP70的替换氨基酸为HVRl区的NRDNAV，所述EV71中和表位SP55的替换氨基酸为HVR2区的TTEGEE。本专利技术还提供了一种人3型腺病毒-EV71的双价疫苗候选株，所述双价疫苗候选株含有上述的重组人3型腺病毒。本专利技术还提供了一种载体，所述载体包含上述的重组人3型腺病毒。本专利技术还提供了一种制备上述重组人3型腺病毒的方法，包括如下步骤:在重组人3型腺病毒基因组E3区插入了 EV71的VPl蛋白表达框，人3型腺病毒六邻体上同时嵌入了两种EV71中和表位，分别替换的氨基酸为HVRl区的NRDNAV，HVR2区的TTEGEE。本专利技术所提供的重组病毒，允许EV71中和表位个别氨基酸的缺失、替换或添加，但需要保持中和表位的免疫原性；允许被置换的HVRl区和HVR2区序列个别氨基酸的缺失、替换或添加，但需要保持腺病毒的稳定性，同时保证外源表位的免疫活性；本专利技术中嵌入的EV71表位并不限于SP70和SP55，也可以是其它的保护性T细胞表位或B细胞表位，但需要保持腺病毒的稳定性和保证外源表位的免疫原性。本专利技术中，插入HAdv3基因组E3区的外源基因表达框中，包含CMV启动子和SV40polyA, EV71的主要抗原VPl蛋白基因序列为EV71-C4亚型的VPl全基因；同时，允许使用其它的真核表达框和其它EV71亚型的VPl全长或部分基因。本专利技术中，在转基因表达EV71的主要抗原VPl蛋白的同时，在六邻体衣壳上同时展示EV71的两种主要中和表位，该重组病毒载体能够逃避预存的腺病毒免疫，产生强烈的抗EV71感染的保护性免本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人3型腺病毒，其特征在于，所述重组人3型腺病毒的基因组E3区插入了EV71的VP1蛋白表达框，所述重组人3型腺病毒的六邻体中嵌入了两种EV71中和表位SP70和SP55，所述EV71中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述中和表位SP55的氨基酸序列为PESRESLAWQTATNPC。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周荣，田新贵，苏晓波，李潇，钟南山，白培胜，
申请(专利权)人：广州医学院第一附属医院，广州呼吸疾病研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44