用于转导脂肪组织的腺相关病毒载体制造技术

本发明专利技术涉及用于转导脂肪组织的腺相关病毒载体。本发明专利技术还涉及用于产生这种腺相关病毒载体的多核苷酸、质粒、载体和方法。本发明专利技术还涉及用于需要调节基因表达水平的疾病的治疗的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于转导脂肪组织的腺相关病毒(AAV)载体。该载体可以以组织特异性的方式转导白色或褐色脂肪组织。
技术介绍
脂肪组织，除了其作为脂肪库以及能量平衡的调节器的已知作用，近来已被认为是主要的新陈代谢和内分泌器官。已经提出，减损的白色脂肪组织(WAT)功能，以及降低的褐色脂肪组织(BAT)活性或BAT质量，是肥胖症(肥胖，obseity)发展的主要因素。在这方面，已经所描述了人类的脂肪细胞和WAT功能障碍。此外，还报告了BAT活性和体重指数(BMI)之间的逆相关。参见Yee J等，Lipids Health Dis.2012，11:19-30、Ichimura A等，Nature 2012；483:350-354、Mazzatti D等，Arch.Physiol.Biochem.2012；118(3):112-120、Cypess A等，N.Engl.J.Med.2009；360:1509-1517和van Marken Lichtenbelt W等，N.Engl.J.Med.2009；360:1500-1508。肥胖症的发病在过去几十年之中已经显著增加以致达到流行病的比例。据估计超过5亿人是肥胖的。肥胖症是现今主要的公共卫生问题。参见IASO，“Global Prevalence of Adult Obesity，Report IOTF 2008”(IASO，London，GB，2009)。肥胖症自身增加死亡的风险并且与胰岛素耐受性和2型糖尿病长期强烈相关。参见Peeters A等，Ann.Intern.Med.2003；138:24-32和Moller D等，N.Engl.J.Med.1991；325:938-948。此外，脂肪细胞的功能障碍和肥胖症对于特定类型的癌症和许多其他严重的疾病，如心脏病、免疫功能障碍、高血压、关节炎和神经退行性疾病而言也是显著的风险因素。见Roberts D等，Annu.Rev.Med.2010；61:301-316、Spiegelman B等，J.Biol.Chem.1993；268(10):6823-6826和Whitmer R等，Curr.Alzheimer Res.2007；4(2):117-122。饮食和锻炼是肥胖症的主要治疗方法，但是越来越多的患者还需要药物治疗干预以降低并保持体重。然而，药物治疗不会引发非自愿的或显著的体重减轻，并且此外，抗肥胖药物经常由于它们的全身作用表现出严重的副作用。因此，存在对于预防并对抗当前的肥胖症流行的新的和安全的途径的急切的需要。在这方面，阐明肥胖症基础的病理事件对于开发新的
抗肥胖症疗法是至关紧要的。候选基因在体内基因转移至白色和褐色脂肪组织可以提供巨大的潜力以了解肥胖症的发病和发作之下的分子机制。此外，目标为脂肪细胞的基因治疗途径可以为未来的肥胖症及其相关的失调的治疗，同时最小化全身的反应开创新的机会。然而，迄今为止转移至白色和褐色脂肪组织的有效的和特定的基因仍然难以确定。最近，当血清型1的AAV(AAV1)与非离子表面活性剂或雷公藤红素结合时，示出其适度感染的小鼠体内的WAT。见Mizukami H等，Hum.Gene Ther.2006；17:921-928和Zhang F等，Gene Ther.2011；18:128-134。已经报告其他AAV血清型，如AAV6、AAV7、AAV8或AAV9是高度感染性的，但是它们的脂肪转导效率是不清楚的。参见Gao G等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002；99:11854-11859、Nakai H等，J.Virol.2005；79:214-224、Pacak C等，Circ.Res.2006；99:e3-e9、Broekman M等，Neuroscience 2006；138:501-510、Wang Z等，Diabetes 2006；55:875-884、Taymans J等，Hum.Gene Ther.2007；18:195-206、Bish L等，Hum.Gene Ther.2008；19:1359-1368和Lebherz C等，J.Gene Med.2008；10:375-382。因此，在本领域中存在对于开发使脂肪组织特定转导，以及，此外使特定类型的脂肪细胞转导的载体的需要。
技术实现思路
本专利技术涉及使感兴趣的多核苷酸转移至特定类型的脂肪细胞并且使它们表达的腺相关病毒载体(AAV)。本专利技术的脂肪组织特异调控元件的使用限制感兴趣的多核苷酸在白色脂肪组织或褐色脂肪组织中的表达。此外，已经证明本专利技术的载体对于脂肪组织相关的疾病，如，例如2型糖尿病的治疗是有用的。本专利技术的专利技术方面在权利要求中公开。微生物保藏质粒pAAV-mini/aP2-null和pAAV-mini/UCP1-null在2012年6月8日分别以登录号DSM 26057和DSM 26058保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，Inhoffenstraβe 7 B，D-38124 Braunschweig，德意志联邦共和国。附图说明图1.通过AAV的eWAT内部给予的白色脂肪细胞的转导。A-B.在用血清型1、2、4和5(A)的AAV-CAG-GFP与普兰尼克F88(Pluronics F88)一起或不与普兰尼克F88(Pluronics F88)一起处理eWAT的部分和用血清型6、7、8和9(B)的AAV-CAG-GFP处理eWAT的部分中针对绿色荧光蛋白(GFP，绿色)的免疫染色。蓝色，细胞核。箭头表示转导的脂肪细胞。初始放大倍数100×(B，左侧图片)和200×(A；B，右侧
图片)。C.用血清型1、6、7、8、或9的AAV-CAG-GFP处理的eWAT中的GFP含量(n＝5每组)。示出的值是平均值±SEM。RLU，相对光单位(relative light unit)。D.接收AAV8-CMV-LacZ的eWAT的全部X-gal着色。X-gal着色分布贯穿整个转导的eWAT。相反地，在来自用生理盐水溶液处理的动物的eWAT中没有检测到X-gal着色。E.由用AAV9-CMV-mHKII或AAV0-CMV-null载体处理的动物的eWAT获得的分离细胞中的相对mHKII表达水平。F.由来自用AAV9-CMV-null和AAV-CMV-mHKII注射的小鼠的分离的脂肪细胞摄取的基础的和胰岛素刺激的2[1-3H]脱氧-D-葡萄糖。脂肪细胞获得自至少5小鼠/组。G.在2×1011vg的AAV8或AAV9-CAG-GFP载体的iWAT内部给予两个星期之后在腹股沟白色脂肪组织(iWAT)部分中的针对GFP(棕色)的免疫染色。初始放大倍数×100。H：注射2×1011vg的AAV8或AAV9-CAG-GFP后两个星期iWAT中的GFP表达水平(n＝6)。示出的值是平均值±SEM。*p<0.05、**p<0.01并且***p<0.001；在相同的胰岛素浓度下相对于AAV9-CMV-null#p<0.05。所有的分析是在2×1011vg/eW本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腺相关病毒载体，包含重组病毒基因组，其中，所述重组病毒基因组包含表达框，所述表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的脂肪组织特异转录调控区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种腺相关病毒载体，包含重组病毒基因组，其中，所述重组病毒基因组包含表达框，所述表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的脂肪组织特异转录调控区。2.根据权利要求1所述的腺相关病毒载体，其中，AAV的血清型选自由AAV6、AAV7、AAV8和AAV9组成的组。3.根据权利要求1或2所述的腺相关病毒载体，其中，所述脂肪组织特异转录调控区包含选自由aP2基本启动子和UCP1基本启动子组成的组的启动子区。4.根据权利要求3所述的腺相关病毒载体，其中，所述脂肪组织特异转录调控区进一步包含与所述启动子区可操作地连接的增强子区。5.根据权利要求4所述的腺相关病毒载体，其中，所述增强子区选自由脂肪特异aP2增强子和脂肪特异UCP1增强子组成的组。6.根据权利要求5所述的腺相关病毒载体，其中，所述转录调控区选自由以下各项组成的组：(i)包含所述脂肪特异aP2增强子和鼠类aP2基本启动子的多核苷酸，以及(ii)包含所述脂肪特异UCP1增强子和大鼠UCP1基本启动子的多核苷酸。7.根据权利要求1至6中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，所述表达框进一步包含转录后调控区。8.根据权利要求7所述的腺相关病毒载体，其中，所述转录后调控区是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，所述感兴趣的多核苷酸编码选自由以下组成的组中的蛋白质：作用于全身的分泌蛋白以及作用于所述脂肪细胞上或其附近的蛋白质。10.根据权利要求1至9中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，所述感兴趣的多核苷酸编码选自由己糖激酶、葡糖激酶、碱性磷酸酶和血管内皮生长因子组成的组中的蛋白质。11.根据权利要求1至10中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，腺相关病毒ITR是AAV2ITR。12.根据权利要求1至11中任一项所述的腺相关病毒载体，其进一步包含至少一种miRNA靶序列。13.根据权利要求12所述的腺相关病毒载体，其中，所述至少一种miRNA靶序列是mirT122a。14.根据权利要求12所述的腺相关病毒载体，其中，所述至少一种miRNA靶序列是mirT1。15.根据权利要求12所述的腺相关病毒载体，其包含至少一个mirT1的拷贝和一个mirT122a的拷贝16.一种药物组合物，包含根据权利要求1至15中任一项所述的腺相关病毒载体。17.根据权利要求1至15中任一项所述的腺相关病毒载体或根据权利要求16所述的药物组合物在药物中的用途。18.根据权利要求1至15中任一项所述的腺相关病毒载体或根据权利要求16所述的药物组合物在疾病的治疗或预防中的用途，所述疾病需要所述感兴趣的多核苷酸在所述脂肪组织中的表达。19.根据权利要求17所述的腺相关病毒载体的用途，其中，所述脂肪组织包含白色脂肪组织。20.根据权利要求17所述的腺相关病毒载体的用途，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦罗尼卡·希门尼斯森萨诺，法蒂玛·博希图贝特，
申请(专利权)人：巴塞罗那自治大学，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES