用于制造重组病毒载体的方法技术

本发明专利技术涉及生产高效价重组病毒载体，更具体地重组AAV载体的方法，使得该方法可以在适合基因治疗技术实际应用的规模上有效使用。合基因治疗技术实际应用的规模上有效使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制造重组病毒载体的方法


[0001]本专利技术涉及生产高效价重组病毒载体，更具体地重组AAV载体的方法，使得该方法可以在适合基因治疗技术实际应用的规模上有效使用。

技术介绍

[0002]基因递送是治疗获得性和遗传性疾病的一种很有前途的方法。已经描述了许多用于基因转移目的的基于病毒的系统，包括基于腺相关病毒(AAV)的系统。
[0003]AAV具有独特的功能，使其作为基因治疗的载体具有吸引力。AAV感染多种细胞类型。然而，它们是非转化的，并且不涉及任何人类疾病的病因。将DNA引入受体宿主细胞通常会导致DNA的长期持续存在和表达，而不会干扰细胞的正常代谢。
[0004]AAV粒子由具有三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的蛋白质衣壳组成，它们包含约4.7kb的线性单链DNA基因组，其中包含Rep和Cap基因，侧翼是病毒反向末端重复序列(ITR)。单个粒子仅包裹一条DNA分子链，但这可能是正链或负链。包含任一链的粒子都具有感染性，通过将亲本感染单链转化为双链体形式并随后进行扩增，后代单链被置换并包装成衣壳，从而发生复制。
[0005]通过删除AAV基因组的内部部分并在ITR之间插入感兴趣的DNA序列，可以将AAV载体设计为携带感兴趣的异源核苷酸序列(例如，选定的基因、反义核酸分子、核酶等)。ITR是顺式复制和包装包含感兴趣的异源核苷酸序列的载体基因组所需的唯一序列。异源核苷酸序列通常还与能够在某些条件下驱动患者靶细胞中基因表达的启动子序列链接。终止信号，例如聚腺苷酸化位点，通常包含在载体中。/>[0006]rep和cap AAV基因产物分别为载体基因组的复制和衣壳化提供功能，它们以反式存在就足够了。
[0007]尽管基因疗法作为人类遗传疾病的治疗方法具有潜在的好处，但严重的实际限制阻碍了其在临床中的广泛应用。从这个意义上说，有必要产生大量的rAAV粒子以产生临床有效剂量。使用当前技术生产大量粒子需要大量生产细胞。在实验室规模，它需要数千个组织培养瓶。在商业规模上，需要更高效、更密集的生产平台才能达到临床应用。从商业生产的角度来看，提高生产细胞的数量和每个细胞的粒子产量的好处将是非常显著的。
[0008]因此，在重组AAV载体(例如用于基因治疗的那些载体)的开发中，需要获得高效价AAV的策略，以便可以在适合基因治疗技术实际应用的规模上有效地使用这些方法。
[0009]本公开提供了实现这些竞争目标的方法，并证明此类技术可用于大规模生产重组AAV载体制剂。
[0010]专利技术概述
[0011]本专利技术的专利技术人已经发现，通过进行重复转染，可以显著提高重组病毒生产，更特别是rAAV生产。如以下实施例所示，与需要单轮转染的常规方法相反，当进行重复转染轮次时，随时间获得持续水平的基因表达。
[0012]因此，在第一方面，本专利技术涉及生产重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步
骤：
[0013]a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述质粒载体包含异源核苷酸序列以及复制和包装基因序列；
[0014]b)在允许病毒复制和包装的条件下培养所述细胞；
[0015]c)回收步骤b)中产生的病毒载体，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；
[0016]d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及
[0017]e)重复步骤b)到c)。
[0018]此外，专利技术人已经发现，用于转染的优化质粒的组合导致比使用通常用于AAV载体生产的标准质粒的生产更高的rAAV产量。此外，如下面的实施例所示，专利技术人惊奇地发现，使用根据本专利技术的优化质粒导致细菌序列的反向包装降低。
[0019]因此，本专利技术的另一方面是生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：
[0020]a)将合适的细胞与以下共转染
[0021]i)包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列的第一质粒载体；
[0022]ii)包含从5'到3'AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的第二质粒载体，以及
[0023]iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA
‑
RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列；
[0024]b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；以及
[0025]c)回收步骤b)中产生的AAV。
[0026]本专利技术人惊奇地发现，通过在转染中使用优化质粒的组合，大大减少了反向包装并且获得了更高的载体基因组产量。
[0027]因此，在另一方面，本专利技术涉及质粒载体，包括：
[0028]a)侧翼为ITR的异源核苷酸序列；以及
[0029]b)位于所述ITR外部并与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400Kb到4800Kb之间，使得质粒骨架大小在5Kb以上，优选在7000bp到7500bp之间；
[0030]其中所述质粒载体在主链序列中不含F1Ori核苷酸序列。
[0031]在另一方面，本专利技术涉及包含腺病毒辅助功能的质粒载体，包括VA
‑
RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。
附图说明
[0032]图1是在用一组标准质粒或一组优化质粒三重转染产生的总vg中表达的AAV9
‑
CAG
‑
cohSgsh的产量。
[0033]图2是由一组标准质粒或一组优化质粒三重转染产生的AAV9
‑
CAG
‑
cohSgsh中存在的细菌序列副本。
[0034]图3是优化质粒pcohSgsh
‑
900单独或与其他优化辅助质粒(pRepCap9
‑
809和pAdhelper861)组合对AAV载体产量(总vg)的影响。
[0035]图4是细菌序列的反向包装。优化的超大质粒pcohSgsh
‑
900单独或与其他优化的辅助质粒(pRepCap9
‑
809和pAdhelper861)组合的效果。
[0036]图5是细菌序列的反向包装。优化的超大质粒pcohSgsh
‑
900与其他优化的辅助质粒(pRepCap9
‑
809和pAdhelper861)组合时的效果。
[0037]图6是用pohIDS
‑
874质粒瞬时转染后回收的总vg。细胞裂解和在执行几轮重新转染后在培养上清液中回收的总vg。时间以转染后的小时数(hpt)表示。
[0038]图7是用pohSGSH
‑
900质粒瞬时转染后回收的总vg。细胞裂解和在执行几轮重新转染后在培养上清液中回收的总vg。时间以转染后的小时数(hpt)表示。
[0039]微生物沉积...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.生产重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述质粒载体包含异源核苷酸序列以及复制和包装基因序列；b)在允许病毒复制和包装的条件下培养所述细胞；c)回收步骤b)中产生的病毒载体，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及e)重复步骤b)到c)。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体和AAV载体。3.生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述载体包含侧翼为ITR、AAV rep和AAV cap基因序列的异源核苷酸序列以及腺病毒辅助功能序列；b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；c)回收步骤b)中产生的AAV，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及e)重复步骤b)到c)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，AAV被分泌到细胞培养物的上清液中。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在步骤d)之前交换所述细胞培养物的细胞培养基。6.根据权利要求5的方法，其中，通过灌注进行细胞培养基交换。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在恢复步骤c)之后至少再重复步骤d)、b)和c)一次。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，步骤b)是通过在搅拌的液体培养基中悬浮培养所述细胞来进行的。9.根据权利要求3至8任一项所述的方法，其中，在步骤a)中使用以下三种质粒载体：i)第一质粒载体，其特征在于质粒骨架大小大于5000pb，优选在7000bp到7500bp之间，并且包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列和位于所述ITR外部，优选与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400pb到4800pb之间；ii)包含从5'到3'的AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的第二质粒载体；以及iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA
‑
RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：巴塞罗那自治大学，
类型：发明
国别省市：