溶瘤腺病毒制造技术

本发明专利技术描述了优先杀死赘生性细胞而非正常细胞的病毒载体和用于生成这些载体的方法，优选载体是用肿瘤特异性启动子（优选Ｅ２Ｆ反应性启动子）替代Ｅ１Ａ和／或Ｅ４区中的内源启动子后生成的腺病毒。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及腺病毒载体，以及用于生成和使用这些载体的方法。更具体的说，本专利技术涉及在E1A和/或E4区启动子中包含突变和替代从而赋予显著的肿瘤细胞特异性溶瘤活性的改良型腺病毒载体。背景早在本世纪早期，病毒就已经被用于治疗癌症。这种方法包括两个部分第一，分离或生成在赘生性细胞中选择性复制并选择性杀死肿瘤细胞同时不伤害正常细胞的溶瘤病毒。研究人员最初使用野生型病毒，这种方法获得了一些但有限的成功。在溶解肿瘤并减缓肿瘤生长且很少或不损伤正常组织的同时，疾病进程却没有显著改变。参阅Smith等人，癌症(Cancer)91211-1218，1956；W.A.Cassel等人，癌症(Cancer)19863-868，1965；H.E.Webb等人，柳叶刀(Lancet)11206-1209，1966；S.Kenney和J.Pagano，国家癌症协会会刊(J.Natl.Cancer Inst.)86(16)1185，1994。最近，由于与野生型病毒应用的有限功效有关的疾病复发，研究人员已经开始采取能够以高剂量投递、能够在赘生性细胞而非正常细胞中复制的重组病毒。这些病毒自身是有效的溶瘤剂，而且经改造能够携带并表达增强病毒抗赘生物活性的转基因。这类病毒的范例是病毒基因组E1B区突变的腺病毒。参阅美国专利号5,677,178；J.R.Bischoff、D.H.Kim、A.Williams、C.Heise、S.Horn、M.Muna、L.Ng、J.A.Nye、A.Sampson-Johannes、A.Fattaey、和F.McCormick，科学(Science)274373-376，1996。重要的是将含或不含用于治疗癌症的转基因的复制型病毒与研究人员使用的第二种方法即表达转基因的非复制型病毒区分开来。在第二种方法中，病毒只作为投递直接或间接负责杀死赘生性细胞的转基因的载体。这种方法已经成为并将继续作为使用病毒治疗癌症的主要方法。然而，它取得的成功有限，而且显得不如复制型病毒有效。不过，已经将外源基因插入E1区(参阅McGrory，病毒学(Virology)163614-617，1988)、E3区(参阅Hanke，病毒学(Virology)177437-444，1990；Bett，病毒学杂志(J.Virol.)675911-5921，1993)，或者插入删除E1区载体的E3区。如上所述，为了避免正常组织受到高剂量病毒疗法的损伤，优选的是，病毒具有促进其在肿瘤细胞中复制由此增强溶瘤活性但对正常细胞基本上无害的突变。这种方法利用了下面的观察结果控制正常细胞生长的许多细胞生长调控机制在赘生性细胞中被灭活或丧失，而且病毒灭活这些相同生长控制机制以促进病毒复制。因而，灭活特定正常细胞生长控制机制的病毒基因删除或灭活将防止病毒在正常细胞中复制，但是这些病毒将在缺乏特定生长控制机制的赘生性细胞中复制并杀死这些肿瘤细胞。例如，正常分裂中细胞瞬时缺乏在某些赘生性细胞中缺乏的并与其无限生长有关的生长控制机制，成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因(RB)。成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因基因功能的丧失与多种类型肿瘤的病因学有关。这种肿瘤抑制基因的产物，称为pRB或p105的105kD多肽，是细胞周期调控蛋白。pRB多肽通过将细胞滞留在细胞周期的G1期来抑制细胞增殖。pRB蛋白质是几种DNA病毒癌蛋白的主要靶，包括腺病毒E1a、SV40大T抗原、和乳头瘤病毒E7。这些病毒蛋白质结合并灭活pRB，而灭活pRB的功能在促进病毒复制中是重要的。pRB蛋白质与涉及腺病毒E2基因和几种细胞基因表达的E2F转录因子相互作用，并抑制这种转录因子的活性(Bagchi等人，细胞(Cell)651063，1991；Bandara等人，自然(Nature)351494，1991；Chellappan等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)894549，1992)。腺病毒癌蛋白E1a破坏pRB/E2F复合物，从而导致E2F的激活。然而，缺乏足够有功能的pRB来复合E2F的赘生性或正常分裂中细胞将不需要功能性癌蛋白(诸如E1a)的存在来拥有转录活性E2F。因而认为，缺乏复合RB能力但基本上保留其它必需复制功能的复制缺陷型腺病毒种类将在RB功能缺陷的细胞(如正常分裂中细胞、对基本上删除RB等位基因而言为纯合子或杂合子的细胞、包含编码基本上无功能的突变型RB蛋白质的RB等位基因的细胞、包含导致RB蛋白质功能缺失的突变的细胞)中展示复制表型，但是在不复制的非赘生性细胞中基本上不展示复制表型。这些复制缺陷型腺病毒种类称为E1a-RB(-)复制缺陷型腺病毒。将细胞群体(诸如混合细胞培养物或人类癌症患者)，其中包括包含赘生性细胞和分裂中正常细胞(二者都缺乏RB功能)的子群体和包含不分裂非赘生性细胞(表达基本上正常的RB功能)的子群体，在感染条件下(即适合腺病毒感染细胞群体的条件，通常是生理学条件)接触包含感染剂量的E1a-RB(-)复制缺陷型腺病毒的组合物。这导致细胞群体受到E1a-RB(-)复制缺陷型腺病毒的感染。这一感染引起了复制表型在包含赘生性细胞和分裂中正常细胞(二者都缺乏RB功能，RB-细胞)的子群体的显著部分细胞中优先表达，但是不引起复制表型在包含不分裂赘生性细胞(具有基本上正常的RB功能)的子群体中显著表达。复制表型在受感染RB-细胞(赘生性细胞或分裂中正常细胞)中的表达导致细胞死亡，诸如通过致细胞病变效应(CPE)、细胞裂解、凋亡、等等，从而由细胞群体选择性消除这些RB-细胞。参阅美国专利号5,801,029和5,972,706。通常，适用于选择性杀死RB-赘生性细胞的E1a-RB(-)复制缺陷型腺病毒构建物包含可灭活E1a多肽有效结合RB蛋白质的能力的突变(如删除、替代、移码)。这些灭活突变通常发生于E1a的CR1结构域(Ad5中第30-85位氨基酸；第697-790位核苷酸)和/或CR2结构域(Ad5中第120-139位氨基酸；第920-967位核苷酸)，它们涉及结合p105 RB蛋白质和p107蛋白质。优选的是，保留CR3结构域(跨越第150-186位氨基酸)，作为截短型p289R多肽表达，并在腺病毒早期基因的反式激活中发挥功能。附图说明图1例示性描绘了E1a-289R多肽的结构域结构。除了腺病毒E1a区中的改变，还希望通过构建在转录活性E2F的控制下具有重要复制功能的病毒来增强对缺乏RB功能的赘生性细胞的病毒特异性杀伤。腺病毒复制周期包括两个阶段早期，在此阶段4个转录单位E1、E2、E3、和E4表达；晚期，发生于病毒DNA复制开始后，晚期转录本主要由主要晚期启动子(MLP)表达。晚期信使编码大多数病毒结构蛋白。E1、E2、和E4的基因产物负责转录激活、细胞转化、病毒DNA复制、以及其它病毒功能，而且是病毒生长所必需的。参阅D.N.Halbert等人，病毒学杂志(J.Virol.)56250-257，1985。若能够通过E2F反应性转录单位将涉及病毒复制的腺病毒区域置于E2F的控制下，这将提供可选择性杀死缺乏RB功能的赘生性细胞而非正常细胞的增强型腺病毒。作为背景，提供涉及腺病毒载体(在涉及病毒复制的区域中，包括E4区中具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含控制病毒基因表达的Ｅ２Ｆ反应性转录核苷酸调控位点的病毒载体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：L约翰逊，A法塔伊，T汉密斯顿，
申请(专利权)人：昂尼克斯药物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]