本发明专利技术涉及棉花β一微管蛋白基因ＣＦＴＵＢ２及其活性片段。这些启动子显示出强纤维特异性活性。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体地涉及转基因植物和用于创建转基因植物的启动子，更具体地涉及纤维特异性启动子。
技术介绍
棉花是纺织工业最广泛使用的天然纤维，全世界棉花年产量为1亿捆，总值450亿美元。在过去的几十年间虽然已通过经典育种明显改进了纤维的品质和产量，但是通过经典育种进一步改善纤维性质的潜力已被限制，因为需要物种相容性和可利用的性状。基因工程提供了进一步改良棉花的新途径，其是通过导入基因以产生具有高度所需特征的新种质而进行。棉花纤维(种毛)是经历快速同步延伸的单细胞毛状体。皮层(cortical)微管提供了规范和调控细胞延伸的纤维素微原纤维排列所需的空间信息(Giddings和Staehelin，1991；Cyr和Palevitz，1995；Fisher和Cyr，1995)。纤维发育由4个重叠阶段组成(即起始、初级细胞壁形成、次生细胞壁形成和成熟)(Basra和Malik，1984)。微管蛋白和肌动蛋白可能在发育纤维细胞中起重要功能作用。成熟纤维是纤维素、水、少量蛋白质、果胶、半纤维素、矿物质、蜡、少量有机酸、糖和色素的生物学组合物，其提供优异的穿着性能和美学(Arthur，1990；Basra和Malik，1984；Ryser，1985)。纤维分化和发育需要许多基因，这些基因在纤维发育的不同阶段差异表达，目前仅鉴别了参与大量纤维特异性结构蛋白、酶、多糖、蜡或木质素的生物合成的一些基因(John和Crow，1992；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Kawai等，1998；Whittaker和Triplett，1999)。这些分离的基因由于其纤维特异性表达可被认为具有改良棉花纤维的潜在应用。例如，John已使用纤维特异性基因启动子产生基因工程棉花以收获改变的纤维(John，1996b，1997a，1997b)。启动子是确定植物和动物发育过程中基因表达的时空特异性的DNA片段。在过去十年间已从各种植物和动物中鉴别和分离了许多组织特异性基因及其启动子，包括一些棉花组织特异性基因和启动子(Loguerico等，1999；Kawai等，1998；Song和Allen，1997；Ma等，1997；John，1996a；Rinehart等，1996；Hasenfratz等，1995；John和Peterson，1994；John和Crow，1992)。有几种启动子以显示在棉花中以纤维特异性方式控制基因表达(Rinehart等，1996；John，1996a；John和Crow，1992)。一些植物组织特异性启动子可被用于在特异组织中以发育调控模式表达外源蛋白质(John，1996b，1997a，1997b)。专利技术概述从棉花中分离了编码β-微管蛋白的纤维特异性基因(命名为CFTUB2)。所分离的完整CFTUB2 cDNA长度为1.623kb，包括1.338kb的开放读框。基于CFTUB2 cDNA的序列，从棉花中分离了两个CFTUB2启动子片段(1.433kb和0.984kb)。将两个CFTUB2启动子片段(1.3和0.9kb)与GUS基因融合以构建用于分析启动子功能的基因表达载体。通过Southem印迹杂交鉴别了具有CFTUB2启动子/GUS融合基因的转基因棉花和烟草植物。在所研究的所有转基因棉花植物中，仅在新生纤维中检测到GUS活性，而在花器官如花药、花瓣和萼片中或在和根中未检测到该活性。这一结果与Northem印迹分析一起提示CFTUB2启动子在棉花中是纤维特异性的。该启动子在棉花纤维中在转录水平控制特异基因表达。所分离的启动子可用于通过基因操作改良棉花纤维，产生具有高纤维品质和产量的新棉花品种。附图简述附图说明图1示出棉花CFTUB2基因cDNA的核苷酸序列(1623bp；SEQID NO1)。图2示出分离的1433bp CFTUB2启动子片段的核苷酸序列(SEQID NO2)，984bp片段相应于这一序列的核苷酸449-1433。图3示出在表达载体中的与gus基因融合的CFTUB2启动子的构建体。详细描述CFTUB2启动子是棉花中的活性纤维特异性启动子。来自各种棉花组织的cDNA的Northern印迹分析结果显示包含CFTUB2基因的一cDNA克隆在8和14 DPA(开花后天数)的初生(young)纤维中强表达，并且在4、8和14 DPA的初生胚珠中也表达，但在所有其它组织中很少表达或不表达。该cDNA克隆的测序揭示其长度为1623bp，含有一1338bp的开放读框(图1)。将棉花CFTUB2的核苷酸和预计的多肽序列与数据库进行比较，发现CFTUB2 cDNA与已知的来自其它植物(如拟南芥属、烟草、水稻、大豆、玉米、马铃薯、胡萝卜等)的β-微管蛋白cDNA和基因在氨基酸水平有96-98％同源性，在核苷酸水平有78％以上的同源性(Liaud等，1992；Snustad等，1992；Villemur等，1994；Tonoike等，1994；Taylor等，1994；Kang等，1994；Okamura等，1997；Chu等，1998；Okamura等，1999)。CFTUB2基因的转录物显示在8 DPA的棉花新生纤维中有最高的积累，随后随着纤维的进一步发育基因产物(mRNA)的积累有一可见的降低。棉花胚珠不同发育阶段中的基因表达的比较也示出基因转录物在8 DPA胚珠中的积累比在4和14 DPA中的积累多，随着从8 DPA至28 DPA纤维发育，基因产物的积累逐渐降低至不可检水平。这提示该基因与其它棉花纤维特异性基因一样在棉花纤维和胚珠发育过程中以转录水平严格调控而特异表达(Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，197；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992)。分离该启动子区的两个片段并分别克隆进pGEM-T载体。CFTUB2启动子的一个片段长度为1433bp(图2)，另一个长度为984bp。两个片段均是有活性的纤维特异性启动子。用CFTUB2启动子/GUS融合基因构建体经农杆菌介导的基因转移转化烟草和棉花，用含有CaMV35S启动子/GUS融合体的pBI121载体作为阳性对照。与Northern印迹分析结果一致，在所研究的所有31个转基因棉花植物中，由CFTUB2启动子驱动的GUS基因特异地在新生纤维中表达，但不在其它组织中表达；而在阳性对照棉花植物(35SGUS)的所有组织中均检测到GUS活性。总共获得36个转化棉花植物，将其移植到土壤中生长成熟。类似地，发现在CFTUB2启动子驱动下的GUS基因活性仅在所研究的所有15个转基因烟草植物的种子中检测到，提示CFTUB2启动子活性在烟草中也是组织特异性的(棉花纤维是种皮的延伸种毛，其与烟草种皮有组织学相应性)。这一结果与上述Northern印迹分析结果一起表明CFTUB2启动子在转录水平控制棉花纤维中基因特异表达。因此，本专利技术的一个实施方案是得自棉花纤维β-微管蛋白基因CFTUB2的纤维特异性启动子。本专利技术的另一实施方案是包含棉花纤维CFTUB2本文档来自技高网...
【技术保护点】
棉花纤维特异性启动子，包括棉花β－微管蛋白基因ＣＦＴＵＢ２的启动子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林，李学宝，程宁辉，刘建伟，
申请(专利权)人：分子农业生物学院，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]
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