菜豆萎蔫病菌的检测基因及其检测试剂盒制造技术

菜豆萎蔫病菌（Ｃｆｆ）的检测基因及其检测试剂盒，属于农作物防病治病及植物检疫范畴。基因位于１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ间的内源转录间隔区的核酸序列，试剂盒包括１０×ＰＣＲ缓冲液、１０×ｄＮＴＰ（Ｍｉｘｔｕｒｅ）、１０×引物ＣｆｆＡ１／引物ＣｆｆＡ２和Ｔａｇ酶。使用该试剂盒对２２个参试细菌进行ＰＣＲ扩增，Ｃｆｆ产生分子量为３８７ｂｐ的特异性扩增产物，其余不明显。达到对Ｃｆｆ快速、简便、准确、灵敏的检测效果。图为：引物ＣｆｆＡ１／引物ＣｆｆＡ２对２２个供试菌的扩增结果电泳图。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术菜豆萎蔫病菌的检测基因及其检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，尤其是对菜豆萎蔫病的病原菌Curtobacterium flaccumfacies pv.flaccumfacies(Cff)的检测。专用于菜豆萎蔫病的田间预防及海关植物检疫的Cff的快速检测。菜豆萎蔫病是我国的一类危险性病害，本世纪首次在美国被发现，现在澳大利亚、加拿大、欧洲、非洲南部地区均报道有发生；除了危害菜豆外，还可危害大豆、绿豆、豇豆、扁豆、丁葵草、月豆等多种豆科植物，人工接种对玉米也有致病作用。菜豆萎蔫病菌属于革兰氏阳性菌，可侵染菜豆植株地上部分所有组织，在幼苗期引起植株矮化而导致产量下降，可产生带病种子，严重时植株死亡。受害幼苗的叶片萎蔫、枯死，该过程中伴随深绿色或褐色病斑。成株期感病后叶片出现深绿色、褐色或红褐色软化的病斑，病害很快发展成系统性侵染，茎上出现锈色病斑，维管束变褐，豆荚出现黄绿色病斑，感病的种子具有不同大小和形状的黄色病斑，严重时种皮下有厚厚的一层细菌，表面侵染的种子则仅仅在种脐处有少许的黄色菌脓。该病害侵染大豆时表现为细菌性褐斑病，只在叶片上出现症状，侵染其它豆科植物时均表现为萎蔫症状。每年此病害能在世界范围内造成很大的经济损失。到目前为止还没有特别有效的化学药剂或抗性品种来防治此病害，因为Cff主要通过种子传播，所以目前主要控制方法是通过种子检验检疫。全世界的学者都认为，有必要建立一种准确率和灵敏度均高的快速检测方法来检测Cff，尤其是无症状的植株或种子的检测。由于该病是我国的一类检疫性病害，因此在我国检疫是主要的控制此病害的手段，严格限制或禁止从发生此病害的国家和地区进口菜豆等种子，从其它国家进口的种子必须进行有关的检验。目前Cff具体的检测手段主要是；1.症状观察，但只能作为初步检验，做出初步判断；2.分离、纯化病原菌，进行革兰氏、鞭毛染色和生理生化反应特性测定。对于Cff，可以使用523，NBY+TTC和NBY+刚果红三种选择性培养基做作为分离培养基(赵友福和高泉准等，菜豆萎蔫病菌的种子检验鉴定技术研究。植物检疫，1997(3)129-133)。3.利用BIOLOG鉴定系统来检测。BIOLOG鉴定系统是一种快速、相对准确且标准化程度高的鉴定系统，主要根据细菌鉴定对95种碳源的利用情况，将结果经计算机处理后并与数据库内已知的细菌比较，实现对待测菌的快速鉴定及检测。但此系统对于Cff来说，只能在种水平上进行鉴定，且准确率为98.5％，而且还需对病原菌先进行分离。4.血清学方法。有人在试验中制备了三种Cff菌株的抗血清，并将之等量混合进行间接免疫荧光染色试验(IIF)，结果表明能与所有的Cff菌株反应，但也能和豌豆带化红球菌和密执安棒型杆菌花叶亚种有弱阳性反应，检测的灵敏度达到4.5×104cfu/ml。事实上用于检测Cff的筛选出的单克隆或多克抗体在特异性和灵敏度上也有缺点，例如不能和所有的Cff菌株杂交或存在与其它相近病菌的交叉反应，影响其阳性鉴定。最近的一个可选择的检测方法是分子生物学方法。在国外已经有较好的例子报道。巴西曾报道说从Cff染色体基因文库中筛选出一个克隆Ppmp-26经过EcoI/Sac I酶切后，得到一个片段仅与Cff杂交而与其它植物病原细菌包括菜豆上的其它原核生物无反应，将此片段亚克隆后进行测序，与数据库中已经报道的序列无很大的同源性。然后根据此片段的序列设计出一对特异性引物可以仅对Cff有反应而与其它细菌无交叉反应。随着近年来我国口岸进口豆类作物的增多，该病菌从疫区进入我国的机会亦增多，但我国口岸缺乏必要的对该病菌的检测方法。病害防治、预测预报及植物检疫需要有准确快速的病菌检测方法，尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测方法，从而可以将之投入到商业生产和应用中，目前在这一领域还没有一种既灵敏特异又快速的Cff检测方法的报道。此项专利技术满足了这些需求。本专利技术的目的是提供菜豆萎蔫病菌的检测基因及其检测试剂盒，克隆Cff的一段位于16S-23S rDNA间的ITS序列，并以此设计出一对Cff的特异性引物和其检测试剂盒，使用该试剂盒达到对样本中Cff的快速准确的检测。本专利技术菜豆萎蔫病菌的检测基因及其检测试剂盒的技术方案是菜豆萎蔫病菌(Cff)的检测基因，其序列位于16S-23S rDNA之间，长度为387bp，序列如下1AGTGCTGGTC GCCCATCATG GGTGGTTGGT TGCTGGTCCA GGCGCCTGTT TCGGACCGAA61 CGTGTCCGAC GGGTAGCTCA TGGGTGGAAC ATTGACAGTG CAGTTGGGAG TGATGCTTCC121 GACCTCAGTA CGCTCTGCTT GCAGGGTTGG GACGGGTCGA GGGTGGAGCT GCTGGCTGGT181 GCACGTTGTT GGGTCCTGAG GGACCAGGCT TCCTACTGTC ACGTGAGTGG TGGTGGGGGT241 TGGGCCTACG GGTCCTTCGT CGGGCCAGGG TGAACCTACT GTTGTGGTGG GGGAGTGCTG301 GTGCCGATCG TATGTTGAGA ACTACACAGT GGACGCGAGC ATCTTTGATT CGCGTCATCC361 ATGATCAACC TTCGGGTTGG TCTGGTG上述菜豆萎蔫病菌(Cff)的检测基因，其引物序列如下CffA1(5′-3′AGTGCTGGTCGCCCATCAT)/CffA2(5′-3′CACCAGACCAACCCGAAGGT)；检测上述菜豆萎蔫病菌(Cff)基因的试剂盒，含有1)10×PCR缓冲液300mM-500mM KCl；10mM-20mM MgCl2；60mM-100mM Tris-HCl；2)10×dNTP(Mixture)5-10mM；3)10×引物CffA1/引物CffA25-15μM；4)Tag酶本专利技术与现有其它技术相比，其优点表现在(1)本专利技术提供一段Cff的检测基因及其高效准确的检测试剂盒。应用该试剂盒可在半天之内达到对Cff快速、简便、准确、灵敏的检测，灵敏度达到2pg纯DNA或3×102CFU/ml，准确性与组织印迹免疫结合分析方法(tissueblot-immunobinding assay，TB-IBA)相当。(2)不需要对样品中的病原菌进行分离和纯化；步骤简单易操作，不需要太多复杂和高级仪器。因为使用了特异性引物和PCR反应，所以可以达到很高的准确率和灵敏度，可以在半天之内完成对样品的检测。这对于海关的植物检疫工作有重要意义。(3)内源转录间隔区(Intemal Transcribed Spacers)的英文缩写为ITS，同时包含保守与变异序列，能根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的鉴定和检测提供了很好的靶位点。例如甘蔗叶烧病病原白纹黄单胞的检测(Y.B.Pan，M.P.Grisham，D.M.Bumer，A polymerase chain reaction protocolfor the detection of Xanthomonas albilineans，t本文档来自技高网...

【技术保护点】
菜豆萎蔫病菌（Ｃｆｆ）的检测基因，其序列位于１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ之间，长度为３８７ｂｐ，序列如下：１ ＡＧＴＧＣＴＧＧＴＣ ＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧ ＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴ ＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡ ＧＧＣＧＣＣＴＧＴＴ ＴＣＧＧＡＣＣＧＡＡ ６１ ＣＧＴＧＴＣＣＧＡＣ ＧＧＧＴＡＧＣＴＣＡ ＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣ ＡＴＴＧＡＣＡＧＴＧ ＣＡＧＴＴＧＧＧＡＧ ＴＧＡＴＧＣＴＴＣＣ１２１ ＧＡＣＣＴＣＡＧＴＡ ＣＧＣＴＣＴＧＣＴＴ ＧＣＡＧＧＧＴＴＧＧ ＧＡＣＧＧＧＴＣＧＡ ＧＧＧＴＧＧＡＧＣＴ ＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴ１８１ ＧＣＡＣＧＴＴＧＴＴ ＧＧＧＴＣＣＴＧＡＧ ＧＧＡＣＣＡＧＧＣＴ ＴＣＣＴＡＣＴＧＴＣ ＡＣＧＴＧＡＧＴＧＧ ＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴ２４１ ＴＧＧＧＣＣＴＡＣＧ ＧＧＴＣＣＴＴＣＧＴ ＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧ ＴＧＡＡＣＣＴＡＣＴ ＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧ ＧＧＧＡＧＴＧＣＴＧ３０１ ＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧ ＴＡＴＧＴＴＧＡＧＡ ＡＣＴＡＣＡＣＡＧＴ ＧＧＡＣＧＣＧＡＧＣ ＡＴＣＴＴＴＧＡＴＴ ＣＧＣＧＴＣＡＴＣＣ３６１ ＡＴＧＡＴＣＡＡＣＣ ＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧ ＴＣＴＧＧＴＧ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭坚华，葛芸英，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]