抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有抗体活性的抗鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌复合卵黄抗体（抗－ＢＡ ＩｇＹ）、制备该抗体的方法及其在制备用于治疗因鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌混合和／或单一感染引起的相关疾病药物或饲料添加剂中的应用。上述方法为：制备鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌复合抗原，将该抗原免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗－ＢＡ ＩｇＹ。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及了一种具有抗体活性的卵黄抗体物质——抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体(抗—BA IgY)产品，并涉及其制备工艺及在禽类药学上的应用。有关鸡细菌混合感染的防治，饲养者通常在雏鸡开食之日起，便在饲料、饮水中添加青霉素、土霉素等抗生素药物，靠该类药物防治禽类细菌性疾病虽对鸡群的成活率有一定的帮助，却直接导致肉禽类食品抗生素残留、激素残留、重金属残留和农药残留大大超过我国自订的绿色无污染标准和国际出口标准；另有部分养殖企业采用中药制剂方式对鸡群进行该类疫病的防治，但由于种种原因，中药制剂禽药的效果不甚理想，其主要原因是禽类对中药药剂的吸收不好，药效在鸡体上得不到较好的体现，因而疫病在鸡群中无法从根本上得到控制。以上几点是我国现行禽类细菌性感染疫病的的主要防治方式，均各有弊端，不利于我国肉禽蛋类产品的质量得到确切有效的提高。长期食用这样的肉食品，将给人们的身体健康带来严重的损害。近年来许多国家都逐渐在使用包括活菌苗、灭活苗、益生菌等生物制剂来控制细菌性感染禽类疫病，这种生物制剂防治鸡细菌感染的效果多数情况下是单一的，相当于药物预防的水平，对混合感染的疾病无能为力，禽类细菌性传染病发病率与死亡率高达50-100％，疫苗对健康动物传染病的预防是根本，但对临床上一定比例发病群体和混合感染的治疗至今是一个难题。鸡卵黄抗体(IgY)是来自鸡血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的结构与IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空间构象。研究表明IgY具有高度的稳定性，对热、酸、碱环境中具有优良的耐受性，同时IgY还具有成本低、易于形成规模化生产的优点。现有技术中未见有通过采用联合沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌作为抗原，免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取的抗—BAIgY和方法的报道。本专利技术针对以上问题，研制出一种方便、高效、无毒副作用的非抗生素生物禽药，用于因鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌感染所引起的禽类感染疾病的防治。因其制备免疫球蛋白的方法较以往的要简单、快速、易于掌握，提取回收率理想，经济效益可观，适于产业化制作。本专利技术通过以沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌菌体为抗原，免疫健康产蛋母鸡，提取活性成分(抗-BAIgY)。为治疗禽混合细菌感染提供一条新思路和新方法，并为进一步制备抗沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌混合感染的免疫生物制剂奠定基础。因此本专利技术所要解决的技术问题之一是针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有抗体活性的抗沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌的新型复合卵黄抗体(抗—BAIgY)。本专利技术所要解决的技术问题之二是提供上述抗沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合卵黄抗体(抗—BAIgY)的制备方法。本专利技术所要解决的技术问题之三是提供上述抗沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合卵黄抗体(抗—BAIgY)在制备用于禽类因沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌单一或混合感染引起的鸡白痢、禽霍乱、鸡大肠杆菌病等禽类细菌感染性疾病的预防或治疗的生物药物制剂及其相关产品应用。本专利技术解决上述技术问题之一所提供的抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体(抗—BAIgY)，其特征在于所述抗—BAIgY按YSDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度；经抗—BAIgY体外拮抗细菌生物活性检测，浓度在200ug/ml时可明显抑制沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌细菌的生长，经奥氏双扩散方法进行抗—BAIgY效价测定抗—BAIgY效价为1∶320-1∶12800。本专利技术解决上述技术问题之二是通过采用这样的技术方案实现的，即一种制备抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体(抗—BAIgY)的方法，其特征在于采用如下的步骤完成1.制备混合菌体抗原(1)培养鸡沙门氏杆菌以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原。(2)培养多杀性巴氏杆菌，以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原。(3)将大肠杆菌接种于麦康凯琼脂平板上，置37℃培养24小时。得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h。收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原。以上抗原按重量比1∶1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得复合菌体抗原，备用。2.将混合菌体抗原按以下的步骤制备抗体(1).对产卵母鸡的免疫A.基础免疫选用产卵母鸡(健康)隔离饲养。进行鸡皮下多点注射鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合菌体抗原，0.5ml/只。B.强化免疫基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂抗原0.5ml/只。C.超强化免疫21天后需超强化免疫1-3次。注射量2.5ml/只，以保持抗体滴度。于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。(2).卵黄抗体的提取①.采用水溶法提取卵黄抗体。从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—BAIgY。或②采用膜过滤法提取卵黄抗体。分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为150KD和200KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—BAIgY。本专利技术所提供的上述抗—BAIgY产品由鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治禽类因鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌单一和或混合感染引起的消化道传染病具有良好的效果。本专利技术采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化。附图的说明附图给出了本专利技术制备方法的工艺流程图。实施例2菌体抗原的制备，病原菌菌株，在营养肉汤培养基中扩大培养24h。收集菌体的，超声波破碎，按重量比1∶1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。实施例3采用如下方式分离提取抗—BAIgY从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—BAIgY。实施例4分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—BAIgY。实施例5取实施例1、3、4中的产品进行IgY纯度检查用PAGE电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度，电泳中只出现一条电泳带，即为提纯的卵黄抗体。实施例6取实施例1、3、4中的产品进行IgY浓度检查将提取的用PBS作5-10倍的稀释，然后用采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。实施例7取实施例1、5、6中的产品进行抗—BAIgY效价测定采用奥氏双扩散方法进行抗—BAIgY效价测定，抗—BAIgY效价为1∶320-1∶12800。实施例8采集抗—BAIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提(即指纯度在95％以上的IgY抗—BAIgY)10克。将葡萄糖10克加入50ml水溶解，100℃灭菌30分钟，将处理过的辅料与50ml超滤液混合均匀，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体（抗－ＢＡＩｇＹ），其特征在于：所述抗体按ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳（７．５％分离胶）检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰Ｒ２５０染色呈蓝色；免疫印记Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；经抗－ＢＡＩｇＹ体外拮抗细菌生物活性检测，浓度在２００μｇ／ｍｌ时可明显抑制沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌细菌的生长，经奥氏双扩散方法进行抗－ＢＡＩｇＹ效价测定：抗－ＢＡＩｇＹ效价为１∶３２０－１∶１２８００。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈君，雁杰，
申请(专利权)人：重庆和润实业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]