抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有抗体活性的抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体（抗－ＥｉｔＩｇＹ）、制备该抗体的方法及其在制备用于治疗因仔猪病原菌（大肠杆菌）感染引起的相关疾病药物或饲料添加剂中的应用。上述抗－ＥｉｔＩｇＹ按ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳（７．５％分离胶）检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰Ｒ２５０染色呈蓝色；免疫印记Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。上述方法为：制备仔猪黄痢、白痢病原菌抗原，将该抗原免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗－ＥｉｔＩｇＹ。用于制备预防或治疗仔猪黄痢、白痢的的药物制剂或饲料添加剂。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及了一种具有抗体活性的卵黄抗体物质——抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)产品，并涉及其制备工艺及在兽类药学和饲料添加剂上的应用。在现代集约化养猪场，仔猪黄痢、白痢几乎无所不在，对养猪生产尤其是规模化养猪威胁较大。朱瑞民(1988)统计表明，台湾有15％-25％的仔猪因黄痢、白痢病无法育成，每年直接经济损失达3.6-6.9亿元。我国大陆目前没有全面统计仔猪黄痢、白痢的发病率和造成的损失，但各地在研究对该病的防治方法时，均在小范围内做过统计。金皓如(1986年)对出栏3.5万头猪场5年的统计结果表明，仔猪黄痢、白痢发病率占全群发病率的40.5％-58％，死亡率占全群死亡的29.5％-45.2％，每年直接经济损失5-10万元。综合许多试验报道表明，在广东、北京、山西、江苏、辽宁、吉林等地，观察近2万头试验空白对照组的仔猪，仅吉林延边自治州1987年因黄痢、白痢死亡9922头仔猪，占存栏数的11.3％。仔猪黄痢、白痢若防治不及时，可造成仔猪体重下降，从而影响后备猪质量，并降低肉猪出栏率，增加药费，提高养猪成本，从而造成严重的经济损失。仔猪出生后主要从母猪乳中获得免疫抗体，形成被动免疫力。仔猪由母乳中获得的抗大肠杆菌的免疫球蛋白在2-3周消耗完，而自身抗体却从3周龄开始产生。因此3周龄是仔猪从母体获得抗体与自身产抗体的转换期，或称青黄不接期，此时仔猪免疫能力下降，最容易患仔猪白痢。当前，临床治疗仔猪黄痢、白痢主要使用抗生素、磺胺类药物及其它化学合成药物，虽然短期效果明显，但长期使用后往往会产生严重的耐药性，使以后治疗效果大大降低，另有采用中药制剂方式对仔猪进行该类疾病的防治，但中药制剂的效果不甚理想，因而疾病在仔猪中无法从根本上得到控制。同时也有许多兽医学者致力于大肠杆菌疫苗的研制。而且剂型仅限于针剂。鸡卵黄抗体(IgY)是来自鸡血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的结构与IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空间构象。研究表明IgY具有高度的稳定性，在热、酸、碱环境中具有优良的耐受性，同时IgY还具有成本低、易于形成规模化生产的优点。目前国内已有病毒、细菌等颗粒性抗原诱导鸡卵黄表达特异性抗体的研究报告。现有技术中未见有通过采用仔猪黄痢、白痢病原菌(大肠杆菌)作为抗原，免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗-EitIgY报道。本专利技术针对以上问题，研制出一种方便、高效、无毒副作用的非抗生素生物制剂—鸡卵黄抗体(抗-EitIgY)，用于因特异性大肠杆菌感染所引起的仔猪黄痢、白痢疾病的防治。针对以往产品只能采取针剂的形式注射使用，使用不便，而加以改进。该抗体稳定性较强、耐酸、碱，可以采取口服形式使用，能保持产品的活性与效价，使用方便，易于推广。因其制备免疫球蛋白的方法较以往的要简单、快速、易于掌握，提取回收率理想，经济效益可观，适于产业化制作。本专利技术通过以仔猪黄痢、白痢病原菌为抗原，免疫健康产蛋母鸡，提取活性成分(抗-EitIgY)，为治疗仔猪黄痢、白痢感染提供一条新思路和新方法，并为进一步制备抗仔猪黄痢、白痢的免疫生物制剂奠定基础。本专利技术所要解决的技术问题之一是针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有抗体活性的抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)。本专利技术所要解决的技术问题之二是提供上述抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)的制备方法。本专利技术所要解决的技术问题之三是提供上述抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)在制备用于因病原菌引起的仔猪黄痢、白痢的预防或治疗的药物制剂或饲料添加剂应用。为解决上述技术问题之一，本专利技术采用的技术方案是这样的，即一种抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)，其特征在于所述抗-EitIgY按SDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。本专利技术解决上述技术问题之二是通过采用这样的技术方案实现的，即一种制备抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)的方法，其特征在于采用如下的步骤完成1、制备仔猪黄痢、白痢病原菌抗原(1)菌体抗原制备分别将大肠杆菌(08、060、0115、0138、0139、0141)菌株，涂布于营养琼脂上，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体。按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。(2)菌毛亚单位抗原制备将菌种按1∶100的比例接种营养肉汤中37℃培养72h，然后3000g 4℃离心10min，沉淀的菌体用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L)，60℃下高速搅拌30min，11000g 4℃离心20min，取上清液重复离心一次，最后上清液为菌毛粗提物。菌毛粗提液中加入1mL氯化镁溶液，使其浓度为0.1mol/L，于4℃静置12h以上，4℃ 24000g离心45min，收集菌毛沉淀。(3)外膜蛋白抗原制备将菌种按1∶50的比例接种营养肉汤中，37℃振荡培养15h，培养物于4℃、5000r/min离心10min，沉淀悬浮10mmol/L，HPES(pH7.4)中，75w输出功率超声波裂解60s，裂解物于4℃、7000r/min离心10min，收集上清液，加入约8倍体积的2％Sarkosyl，室温作用20min后，于10℃、35000r/min离心1h，沉淀悬浮于10mmol/L，HEPES(pH7.4)，备用。以上所得按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得免疫抗原。2、将菌体抗原按以下的步骤制备抗体(1)对产卵母鸡的免疫I、基础免疫选用产卵母鸡(健康)隔离饲养，进行鸡皮下多点注射复合抗原，0.5ml/只。II、强化免疫基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂复合抗原0.5ml/只。III、超强化免疫21天后需超强化免疫1-3次，注射量1ml/只，以保持抗体滴度。于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。(2)卵黄抗体的提取①.采用水溶法提取卵黄抗体从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上层清液浓缩、冷冻干燥，得到抗-EitIgY。或②采用膜过滤法提取卵黄抗体分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为300KD和100KD的膜分别过滤，收集蛋白物质，冷冻干燥得到抗-EitIgY。本专利技术所提供的上述抗-EitIgY产品由仔猪黄痢、白痢病原菌免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治仔猪大肠杆菌感染引起的仔猪黄痢、白痢疾病具有良好的效果。本专利技术采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化。由于解决上诉技术问题，抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)可制成粉剂、散剂、水剂等剂型，可以口服应用，使用方便。附图的说明附图给出了本专利技术制备方法的工艺流程图。实施例2菌体抗原的制备，将病原菌菌株，在营养肉汤培养基中扩大培养24h。收集菌体，按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。实施例3菌毛亚单位抗原制备，将菌种按1∶100的比例接种营养肉汤中37℃培养72h，然后3000g 4℃离心10min，沉淀的菌体用Tris-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体（抗－ＥｉｔＩｇＹ），其特征在于：所述抗－ＥｉｔＩｇＹ按ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳（７．５％分离胶）检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰Ｒ２５０染色呈蓝色；免疫印记Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度；经体外拮抗细菌生物活性检测，抗－ＥｉｔＩｇＹ浓度在５００μｇ／ｍｌ时，表现出对仔猪黄痢、白痢病原菌（大肠杆菌）有明显的抑制作用；经奥氏双扩散法对抗－ＥｉｔＩｇＹ进行效价测定：效价为１∶１６０－１∶１２８００。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：雁杰，陈君，
申请(专利权)人：重庆和润实业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]