【技术实现步骤摘要】
人工合成的microRNA簇及其构建方法与所用合成microRNA单元
本专利技术涉及合成生物学领域中的人工合成的microRNA簇及其构建方法与所用合成microRNA单元。
技术介绍
RNA干扰(RNAinteference，RNAi)是一种在真核生物中普遍存在的由双链RNA介导的特异性的基因沉默现象，其介导基因沉默的主要方式是通过与靶基因mRNA互补配对并使其降解或通过与靶基因mRNA非完美配对引起翻译阻遏。基于该现象发展出的技术就是RNAi技术。可以介导RNAi的小RNA分子或质粒载体包括siRNA、shRNA和合成microRNA(miRNA)。其中，microRNAs(miRNAs)是一类长度为18-26nt的小RNA分子，在转录后(post-transcription)基因表达调控中发挥着重要作用。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中，成熟miRNA的生物发生(biogenesis)过程是在细胞核和细胞质中完成的。首先,在细胞核内，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成原初miRNA(primarymiRNA,pri-miRNA)，然后由Drosha和DGCR8(DiGeorgesyndromechromosomalregion8)蛋白复合物加工成长度约为65nt的具发夹环结构的前体miRNA(precursormiRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA在运转蛋白Exoportin5的作用下，从细胞核运输到细胞质中，然后在Dicer酶的作用下被切割成约18–26nt的具有miRN...
【技术保护点】
合成miRNA簇，是由X个合成miRNA单元串联而成的RNA分子，所述合成miRNA单元是人工合成的pri‑miRNA，所述X为4‑18的一个自然数，所述X个合成miRNA单元特异靶向1个或1个以上且不超过所述X个的位点；每个所述合成miRNA单元是SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的四种RNA中的任一种RNA；SEQ ID No.1‑4中，第29‑49位是靶向靶基因mRNA的miRNA的反义序列，第69‑87位是靶向靶基因mRNA的miRNA的正义序列。
【技术特征摘要】
1.合成miRNA簇，是由X个合成miRNA单元串联而成的RNA分子，所述合成miRNA单元是人工合成的pri-miRNA，所述X为4-18的一个自然数，所述X个合成miRNA单元特异靶向1个或1个以上且不超过所述X个的位点；每个所述合成miRNA单元是SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的四种RNA中的任一种RNA；SEQIDNo.1-4中，第29-49位是靶向靶基因mRNA的miRNA的反义序列，第69-87位是靶向靶基因mRNA的miRNA的正义序列。2.权利要求1所述合成miRNA簇的相关生物材料，所述相关生物材料为A1)-A20)中任一种：A1)编码所述合成miRNA簇的DNA分子；A2)含有A1)所述DNA分子的表达盒；A3)含有A1)所述DNA分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述DNA分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述DNA分子的人或动物的转基因细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的人或动物的转基因细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的人或动物的转基因细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的人或动物的转基因细胞系；A13)含有A1)所述DNA分子的人或动物的转基因组织；A14)含有A2)所述表达盒的人或动物的转基因组织；A15)含有A3)所述重组载体的人或动物的转基因组织；A16)含有A4)所述重组载体的人或动物的转基因组织；A17)含有A1)所述核酸分子的人或动物的转基因器官；A18)含有A2)所述表达盒的人或动物的转基因组织；A19)含有A3)所述重组载体的人或动物的转基因组织；A20)含有A4)所述重组载体的人或动物的转基因组织。3.构建权利要求1所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法，其特征在于：所述方法利用Goldengate体外组装编码所述合成miRNA簇的DNA分子，所述合成miRNA簇中所述X为4-6中的一个自然数，所述构建方法包括：在同一个反应体系内，用名称为限制性核酸内切酶E的IIs型限制性内切酶切割pSMC-E，得到名称为E粘性末端pSMC线性载体的双链DNA片段，所述E粘性末端pSMC线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸；用所述限制性核酸内切酶E切割X种pri-miRNA基因载体，得到X种名称为E粘性末端pri-miRNA基因的双链DNA片段，所述X种E粘性末端pri-miRNA基因两端均具有4个游离未配对核苷酸；所述E粘性末端pSMC线性载体和所述X种E粘性末端pri-miRNA基因通过粘性末端互补配对连接得到名称为pSMC-E-X的载体，所述pSMC-E-X为所述合成miRNA簇的重组表达载体；所述pSMC-E含有启动子，所述启动子是依赖于RNA聚合酶II的组成型启动子或诱导型启动子，所述pSMC-E在所述启动子下游含有两个所述限制性核酸内切酶E位点；所述X种pri-miRNA基因载体中每种pri-miRNA基因载体均携带一个不含所述限制性核酸内切酶E位点和限制性核酸内切酶B位点的pri-miRNA基因，所述X种pri-miRNA基因载体所携带的所述X种pri-miRNA基因的序列不同；每个所述pri-miRNA基因编码的pri-miRNA是SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的四种RNA中的任一种RNA；所述每种pri-miRNA基因载体含有两个所述限制性核酸内切酶E位点，两个所述限制性核酸内切酶E位点分别位于所述pri-miRNA基因的上游和下游；所述每种pri-miRNA基因载体经所述限制性核酸内切酶E切割后得到两端具有粘性末端的含所述pri-miRNA基因的DNA片段；所述X为4-6中的一个自然数。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：每种所述pri-miRNA基因载体按照如下方法制备：A11)制备名称为B粘性末端pre-miRNA基因的两端均为粘性末端的双链DNA和名称为pMR的载体；所述B粘性末端pre-miRNA基因编码1个特异于一个靶位点的pre-miRNA，所述pre-miRNA为成熟miRNA的前体，所述B粘性末端pre-miRNA基因的两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸；所述B粘性末端pre-miRNA基因不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点；所述pMR含有两个所述限制性核酸内切酶B位点、两个所述限制性核酸内切酶E位点、5’侧翼编码区、3’侧翼编码区；两个所述限制性核酸内切酶B位点分别位于所述5’侧翼编码区的下游和所述3’侧翼编码区的上游；两个所述限制性核酸内切酶E位点分别位于所述5’侧翼编码区的上游和所述3’侧翼编码区的下游；所述5’侧翼编码区编码所述成熟miRNA对应的pri-miRNA的5’侧翼区，所述3’侧翼编码区编码所述成熟miRNA对应的pri-miRNA的3’侧翼区；所述5’侧翼编码区和所述3’侧翼编码区均不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性内切酶B位点；所述5’侧翼区和所述3’侧翼区为F1或F2或F3或F4：F1、所述5’侧翼区是SEQIDNo.1的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.1的第88-131位所示的RNA；F2、所述5’侧翼区是SEQIDNo.2的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.2的第88-130位所示的RNA；F3、所述5’侧翼区是SEQIDNo.3的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.3的第88-130位所示的RNA；F4、所述5’侧翼区是SEQIDNo.4的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.4的第88-130位所示的RNA；A12)用所述限制性核酸内切酶B切割所述pMR，得到名称为B粘性末端pMR线性载体的双链DNA片段，所述B粘性末端pMR线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸，所述B粘性末端pMR线性载体和所述B粘性末端pre-miRNA基因通过粘性末端互补配对连接得到含有一个pri-miRNA的编码基因的一种pri-miRNA基因载体，所述pri-miRNA基因载体含有两个所述限制性核酸内切酶E位点，所述一个pri-miRNA的编码基因位于两个所述限制性核酸内切酶E位点之间；所述一个pri-miRNA的编码基因不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点；所述限制性核酸内切酶B和所述限制性核酸内切酶E为识别位点不同的IIs型限制性内切酶。5.构建权利要求1所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法，其特征在于：所述方法利用Goldengate体外组装编码所述合成miRNA簇的DNA分子，所述合成miRNA簇中所述X为4-18中的一个自然数，所述构建方法包括：在同一个反应体系内，用限制性核酸内切酶B切割Z种亚SMC载体和pSMC-B并用连接酶进行连接，得到名称为pSMC-B-X的载体，所述pSMC-B-X即为所述合成miRNA簇的重组表达载体；所述Z种亚SMC载体按照如下方法构建：用所述限制性核酸内切酶E酶切X种pri-miRNA基因载体得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的X种pri-miRNA的编码基因片段；用所述限制性核酸内切酶E酶切Y种接头载体，得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的Y种DNA测序接头片段；用所述限制性核酸内切酶E酶切Z种pMM载体，得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的Z种pMM线性载体；将所述X种pri-miRNA的编码基因片段、所述Y种DNA测序接头片段和所述Z种pMM线性载体通过两端的4个游离未配对核苷酸的互补配对连接得到所述Z种亚SMC载体；在同一个反应体系内，对不超过6种所述pri-miRNA基因载体、2种所述接头载体和1种所述pMM载体进行所述酶切和所述连接；所述Z种亚SMC载体中，每种亚SMC载体由一种所述pMM线性载体、不超过6种所述pri-miRNA的编码基因片段和2种所述DNA测序接头片段连接而成，所述pMM线性载体含有两个所述限制性核酸内切酶B位点，不超过6种所述pri-miRNA的编码基因片段连在一起形成pri-miRNA基因簇，2种所述DNA测序接头片段分别位于所述pri-miRNA基因簇的两侧，所述两个所述限制性核酸内切酶B位点分别位于所述DNA测序接头的两侧；所述限制性核酸内切酶B和所述限制性核酸内切酶E为识别位点不同的IIs型限制性内切酶；所述X种pri-miRNA基因载体中每种pri-miRNA基因载体均携带一种不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点的pri-miRNA基因，所述X种pri-miRNA基因载体所携带的所述X种pri-miRNA基因的序列不同；每种所述pri-miRNA基因编码的pri-miRNA是SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的四种RNA中的任一种RNA；所述每种pri-miRNA基因载体含有两个所述限制性核酸内切酶E位点，两个所述限制性核酸内切酶E位点分别位于所述pri-miRNA基因的上游和下游；所述每种pri-miRNA基因载体经所述限制性核酸内切酶E切割后得到两端具有粘性末端的含所述pri-miRNA基因的DNA片段；所述X为4-18中的一个自然数；所述Y种接头载体中，所述Y的取值取决于所述X，如所述X除以6的数值为整数，将所述X除以6的数值以A表示，Y等于2A；如所述X不能被6整除，将所述X除以6的数值中的个位数以B表示，Y等于2×(B+1)；所述Y种接头载体中每种接头载体均携带一种不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点的DNA测序接头，所述Y种接头载体所携带的DNA测序接头的序列不同，所述每种接头载体含有两个所述限制性核酸内切酶E位点，所述两个限制性核酸内切酶E位点分别位于所述DNA测序接头的上游和下游；所述每种接头载体经所述限制性核酸内切酶E切割后得到具有两个粘性末端并含有所述DNA测序接头的DNA片段；所述Z种pMM载体中，所述Z的取值取决于所述X，如所述X除以6的数值为整数，将所述X除以6的数值以A表示，Z等于A；如所述X不能被6整除，将所述X除以6的数值中的个位数以B表示，Z等于B+1；每种所述pMM载体均含有两个所述限制性核酸内切酶B位点和两个所述限制性核酸内切酶E位点；所述pSMC-B含有启动子，所述启动子是依赖于RNA聚合酶II的组成型启动子或诱导型启动子，所述pSMC-B在所述启动子下游含有两个所述限制性核酸内切酶B位点。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：每种所述pri-miRNA基因载体按照如下方法制备：A11)制备名称为B粘性末端pre-miRNA基因的两端均为粘性末端的双链DNA和名称为pMR的载体；所述B粘性末端pre-miRNA基因编码1个特异于一个靶位点的pre-miRNA，所述p...
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