本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗单纯疱疹病毒２型感染所致生殖器疱疹的新型重组腺病毒载体二价活疫苗。本发明专利技术利用分子生物学技术将含单纯疱疹病毒２型糖蛋白Ｂ和糖蛋白Ｄ基因的全长序列的表达盒和细胞因子白介素２表达盒克隆至腺病毒载体上构成。该疫苗是复制缺陷型腺病毒载体活疫苗，进入人体后仅能表达保护性抗原而无致病作用，安全性高，可以模拟野生型疱疹病毒感染特性，有效地诱导的机体粘膜和体液免疫应答和细胞免疫应答，降低人群发病率，清除已感染病毒，控制疱疹的复发和传播。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种抗2型单纯疱疹病毒感染所致生殖器疱疹的新型重组腺病毒载体二价活疫苗。
技术介绍
生殖器疱疹是仅次于艾滋病的病毒性性传播疾病，其病原体主要是2型单纯疱疹病毒，占原发感染的90％以上。II单纯疱疹病毒人类后主要引起生殖系统原发性和复发性疱疹，可以终生潜伏在神经节内，在机体感染免疫力降低时复发。孕妇感染HSV-II型病毒后易发生流产，也可致胎儿先天畸形或智力低下。新生儿在分娩时感染可导致高热、呼吸困难或中枢神经系统病变，其中60％-70％的新生儿可能死亡。此外，有研究表明，生殖器疱疹可将艾滋病感染风险增加2-3倍，并促进艾滋病病毒的传播。目前并无生殖器疱疹，尤其是复发性生殖器疱疹特效治疗方法，也有研究表明，安全套不能有效预防疱疹病毒感染，所以，世界范围内生殖器疱疹发病率逐年上升，美国最新统计数据显示，美国成人生殖器疱疹患病率已经上升到了25％，可以说每四个成人中就有一人罹患生殖器疱疹，因此迫切需要开发能有效防治生殖器疱疹的疫苗。过去几十年来世界各国HSV疫苗的研究结果表明，传统的灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性弱，仅能诱导体液免疫应答，细胞免疫诱导效果较差；减毒活疫苗存在安全隐患，具有致癌风险；新型DNA疫苗虽能同时诱导体液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着更大的作用，但上述几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的疫苗上市。近年来，病毒载体活疫苗逐渐引起了疫苗研究者的重视，其中的腺病毒载体更是以其独特的优势博得了研究者的青睐。首先，腺病毒载体的安全性已经在临床上得到了实践的检验，世界上有关腺病毒载体的临床实验达数百项，而中国已经有两种腺病毒载体抗肿瘤药物上市。其次，国内外诸多研究证明，腺病毒载体疫苗可以经粘膜途径免疫，可以模拟野生型病毒的感染过程，有效地诱导粘膜免疫和细胞免疫应答，是新型疫苗的优良载体。此外，腺病毒载体构建和生产工艺已经成熟，工业化生产不存在任何问题。近年来的研究发现，HSV膜表面的糖蛋白B和糖蛋白D是其感染必需糖蛋白，在HSV的感染过程中发挥着根本性的作用，缺一不可，同时二者也是诱发免疫应答最强的两种糖蛋白，目前大多数疱疹亚单位糖蛋白疫苗都是选择这两种糖蛋白作为研究对象。目前一些DNA疫苗的研究发现细胞因子如白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等等可以起到免疫佐剂的作用，被称为是分子佐剂，可显著地增强疫苗的免疫效果。本专利技术利用现代分子生物学技术，首次制备了携带HSV-II型保护性抗原-糖蛋白D和糖蛋白B，同时能够表达分子佐剂IL-2的二价重组腺病毒载体活疫苗。-->
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可防治HSV-2感染所致生殖器疱疹的重组腺病毒载体二价活疫苗的制备及应用方法。本专利技术涉及一种重组腺病毒载体二价活疫苗，由携带HSV-2糖蛋白B和糖蛋白D基因的全长序列的表达盒和携带细胞因子白介素2表达盒的重组腺病毒载体构成。具体来说就是通过同源重组将IL-2表达盒插入腺病毒载体质粒pAdeasy-1中，构建表达IL-2的腺病毒载体，再从野生型2型单纯疱疹病毒中用PCR技术将其糖蛋白B和糖蛋白D的全长序列扩增出来，再通过同源重组插入到表达IL-2的腺病毒载体中，疫苗质粒即构建成功，将疫苗质粒用PacI酶切后转化到293细胞中，待293细胞出现细胞病变效应时收获病毒即成功制备可防治生殖器疱疹的重组腺病毒载体二价活疫苗JSA01BD。本专利技术用以构建重组腺病毒所需的质粒购自stragene公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录。插入的糖蛋白B基因来源于野生型2型单纯疱疹病毒基因组的UL27基因的全部编码序列。插入的糖蛋白D基因来源于野生型2型单纯疱疹病毒基因组的US6基因的全部编码序列。本专利技术中的IL-2是以genebank中的人类白介素2的参考序列为依据，经密码子优化后合成而得到的，由SV40启动子和PolyA共同构成IL-2表达盒。本专利技术的有益效果：相比传统疫苗而言，1、本疫苗是复制缺陷型腺病毒载体活疫苗，进入人体后仅能表达保护性抗原而无致病作用，安全性高。2、本疫苗属于活疫苗，可以模拟野生型疱疹病毒感染特性，具有较高的感染能力和较高的免疫原性。3、能有效地诱导的机体粘膜和体液免疫应答，构建机体抵抗疱疹感染的第一道防线，降低人群发病率。4、可以有效地激发细胞免疫应答，构建机体的第二道防线，并有可能清除已感染病毒，控制疱疹的复发和传播。附图说明图1重组腺病毒载体JSA01BD酶切鉴定图谱图2重组腺病毒载体JSA01BD结构图具体实施方式实施例1重组腺病毒载体二价活疫苗JSA01BD的制备1.分离野生型HSV-2(1).取临床HSV感染的病人疱疹液和分泌物，加入1mlPBS缓冲液后用0.45微米滤器过滤。(2).取一六孔板，每孔传2×105个Vero细胞，在5个孔内每孔加入200微升病毒过滤液，一孔留作对照。(3).放入37℃二氧化碳培养箱中培72小时后观察发现孔内出现细胞病变(CPE)。(4).待六孔板孔内细胞出现完全CPE后将培养基和细胞一起收入离心管中。(5).将离心管在37℃-负80℃下冻融3次，5000转离心10分钟后将上清转入2ml EP管中，放入负80℃冰箱中备用。-->(6).自EP管中取200微升病毒液，利用HSV分型鉴定引物分型，分离得一株HSV-2.2.提取HSV-2基因组(1)感染前一天，胰酶消化并计数vero细胞，每个10cm平皿接种3×106细胞，补足10mL含血清正常细胞生长培养液。(2)感染当天，确认细胞达到80-90％融合。加原始HSV-2病毒粗体液100微升(如果已知滴度则按MOI 10)到细胞中，蜗旋平皿轻轻混匀。(3)在37℃CO2培养箱培养，允许感染继续至细胞80-90％圆缩漂期(一般感染后2-3天)。(4)收获细胞于无菌的带盖子15mL离心管中(可选择小心弃去原培养基，仅收取细胞，可以起到浓缩病毒的效果，但会丢失单上清液中许多病毒颗粒)，置离心管于-80℃30分钟，然后在37℃水浴15分钟解冻。重复此步骤三次，3000转离心15min。(5)收集上清-80℃保存。(7)0.45微米过滤后加保护剂保存于-80℃。若需要长期保存，则加入10％甘油，置于-80℃。HSV-2在4℃保存时滴度下降比较快，所以HSV-2应该分装保存在一80℃，每次使用时取出实验所需量，一次用完，无需反复冻溶，既能保证每次使用的滴度，又能大大降低HSV-2被污染的机率。(8)取300微升病毒液加入700微升高纯水，加入10微升蛋白酶K、10％的SDS50微升(使终浓度分别稀释为蛋白酶K的100倍稀释、SDS的50倍稀释)混匀。37℃水浴过夜。(9)加入同体积的酚12000rpm离心5min。收集上层液体。一般情况下抽提2-3次，至无蛋白析出。(10)加入同体积的酚氯仿异戊醇(即500微升氯仿异戊醇、500微升酚)12000rpm离心5min抽提2-3次，收集上层液体。(11)加入4℃预冷的十分之一体积的乙酸钠、2.5倍体积的-20℃预冷的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单纯疱疹病毒Ⅱ型重组腺病毒载体二价活疫苗，其特征在于重组腺病毒载体携带糖蛋白Ｂ基因和糖蛋白Ｄ基因表达盒和人白介素２基因表达盒。
【技术特征摘要】
1.一种单纯疱疹病毒II型重组腺病毒载体二价活疫苗，其特征在于重组腺病毒载体携带糖蛋白B基因和糖蛋白D基因表达盒和人白介素2基因表达盒。2.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒II型重组腺病毒载体二价活疫苗，其特征在于所携带糖蛋白B基因和糖蛋白D基因表达盒位于腺病毒载体的E1区。3.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒II型重组腺病毒载体二价活疫苗，其特征在于所携带糖蛋白B基因和糖蛋白D基因来源于野生型单纯疱疹病毒II型。4.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒II型重组腺病毒载体二价活疫苗，其特征在于所携带糖蛋白B基因和糖蛋白D基因表达盒是糖蛋白B编码序列和糖蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘景伟，张利娟，胡军，
申请(专利权)人：郑州金森生物科技工程有限公司，
类型：发明
国别省市：41[]
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